Uso del inmunoblot ( Western blot) en el laboratorio clinico para la deteccion de distrofina, disferlina y calpaina 3: tres proteinas de relevancia en el diagnostico de miopatias hereditarias

CUCCI, M; BETTINI, M; GRIGERA, PR; WILDA M; GIMÉNEZ, M; SORROCHE, PB; RUGGIERO, MF; CHRISTIANSEN, S

Bioquímica y Patología Clínica

Asociación Bioquímica Argentina

Lugar: Buenos Aires, Argentina; Año: 2016 vol. 80 p. 28 - 33

1515-6761

La ausencia y/o disfunción de 3 proteínas constitutivas del músculo, distrofina(UniProtKB - P11532) en el caso de las distrofinopatías y, disferlina(UniProtKB - O75923) y calpaína 3 (UniProtKB - P20807) en lasdistrofias de cadera, juegan un papel central en la etiología de estas miopatías hereditarias. La confirmación de su presencia o ausencia en biopsias musculares es de relevancia diagnóstica y marca la necesidad de contar en el laboratorio clínico hospitalario con una técnica sensible y específica, que permita la detección e identificación de estas tres proteínas en nuestros pacientes. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo de inmunoblot(Western blot, WB) adaptable al laboratorio de análisis clínicos hospitalario,para la detección de 3 proteínas constitutivas del músculo (distrofina, disferlina y calpaína 3) en material extraído de biopsias de pacientes. Aproximadamente 20 - 40 mg de biopsia muscular fue desnaturalizadaen presencia de detergente SDS y mercaptoetanol por 10 minutos a 100° C y, posteriormente, analizadas en PAGE / SDS en formato mini-gel seguido de transferencia a membranas de nitrocelulosa e incubacióncon anticuerpos monoclonales(MAbs) con reactividad específica para las tres proteínas musculares mencionadas y revelado cromogénico y/o quimiolumínico. El protocolo presentado permite el análisis de un amplio rango de pesos moleculares que incluye a las 3 proteínas de interés: distrofina(430 Kd), disferlina(250 Kd) y calpaína 3 (95 Kd). La detección e identificación está basada tanto en la determinación del peso molecular relativo como en la reacción unívoca con anticuerpos monoclonales específicos. En el caso de calpaína 3 la técnica es capaz de detectar e identificar fragmentos de auto procesamiento en el rangode 55 - 60 Kd, un dato indicativo, no sólo de la presencia y expresión del respectivo gen, sino también de la funcionalidad de su producto. Se discute la conveniencia de utilizar quimioluminiscencia o cromógenos en el revelado del WB.Palabras clave: distrofina, disferlina, calpaína 3, inmunoblot.