Caracterización de la Actividad Enzimática de D-Aminoácido Oxidasa en Solución y sobre Superficies Sólidas

HERRERA, ELISA; CAROT, M. LUCRECIA; GIACOMELLI, CARLA E.

Salta, Argentina

Congreso; XVI Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica; 2009

Asociacion Argentina de Investigación en Fisicoquímica

La D-aminoácido oxidasa (DAAO) cataliza la conversión de D-aminoácidos a sus correspondientes a-cetoácidos. La presencia de D-aminoácidos en fluidos cerebrales ha sido relacionada con diferentes desordenes mentales. Además, estos aminoácidos se utilizan como marcadores para determinar la actividad bacteriana y los procesos de fermentación en productos alimenticios. Por lo tanto, el desarrollo de una herramienta analítica para la detección y cuantificación de D-aminoácidos permitirá no sólo un mejor diagnóstico de enfermedades sino también una adecuada estrategia para determinar calidad y origen de alimentos. Una de las vías más eficiente para lograr alta especificidad y sensibilidad en los métodos de detección, es la adsorción (química o física) de una biomolécula (DAAO) sobre una superficie, para que actúe como el elemento de reconocimiento de un determinado analito (D-aminoácidos) presente en la muestra. El presente trabajo tiene como objetivo caracterizar la actividad enzimática de la DAAO, tanto en solución acuosa como adsorbida, para determinar las condiciones de pH y fuerza iónica óptimos que permitan mantener la capacidad de reconocimiento de la enzima sobre la superficie. La actividad de la enzima se analizó a través de la detección amperométrica del producto de reacción, H2O2, utilizando Análisis por Inyección en Flujo (FIA) en función del pH (5, 7 y 8,5) y de la fuerza iónica (5mM y 100mM). Se trabajó aplicando un valor de potencial constante de 0,8 V vs electrodo de Ag/AgCl, a temperatura ambiente utilizando D-alanina como sustrato. Los resultados obtenidos con el método electroquímico se compararon con la actividad determinada para Espectroscopía UVvisible. La actividad enzimática de la DAAO en solución acuosa depende del pH y aumenta ligeramente con la fuerza iónica. La mayor actividad se encontró a pH 8,5, tal como se ha informado utilizando otros métodos de determinación [Boselli, A., et al Biochimie 89 (2007) 360e368]. Por otro lado, se observa una considerable disminución de la actividad de la enzima en el estado adsorbido, indicando que la superficie perturba la estructura tridimensional de la proteína. La actividad de la DAAO adsorbida también depende del pH, la mejor respuesta se observa a pH cercanos al PIE (7) de la enzima. Las determinaciones realizadas con el sistema FIA-amperométrico permiten obtener valores que siguen la tendencia de los resultados obtenidos por espectroscopía Uv-vis. En consecuencia, ambas técnicas resultan viables para caracterizar la actividad enzimática. La actividad enzimática de la DAAO en solución acuosa depende del pH y aumenta ligeramente con la fuerza iónica. La mayor actividad se encontró a pH 8,5, tal como se ha informado utilizando otros métodos de determinación [Boselli, A., et al Biochimie 89 (2007) 360e368]. Por otro lado, se observa una considerable disminución de la actividad de la enzima en el estado adsorbido, indicando que la superficie perturba la estructura tridimensional de la proteína. La actividad de la DAAO adsorbida también depende del pH, la mejor respuesta se observa a pH cercanos al PIE (7) de la enzima. Las determinaciones realizadas con el sistema FIA-amperométrico permiten obtener valores que siguen la tendencia de los resultados obtenidos por espectroscopía Uv-vis. En consecuencia, ambas técnicas resultan viables para caracterizar la actividad enzimática. El presente trabajo tiene como objetivo caracterizar la actividad enzimática de la DAAO, tanto en solución acuosa como adsorbida, para determinar las condiciones de pH y fuerza iónica óptimos que permitan mantener la capacidad de reconocimiento de la enzima sobre la superficie. La actividad de la enzima se analizó a través de la detección amperométrica del producto de reacción, H2O2, utilizando Análisis por Inyección en Flujo (FIA) en función del pH (5, 7 y 8,5) y de la fuerza iónica (5mM y 100mM). Se trabajó aplicando un valor de potencial constante de 0,8 V vs electrodo de Ag/AgCl, a temperatura ambiente utilizando D-alanina como sustrato. Los resultados obtenidos con el método electroquímico se compararon con la actividad determinada para Espectroscopía UVvisible. La actividad enzimática de la DAAO en solución acuosa depende del pH y aumenta ligeramente con la fuerza iónica. La mayor actividad se encontró a pH 8,5, tal como se ha informado utilizando otros métodos de determinación [Boselli, A., et al Biochimie 89 (2007) 360e368]. Por otro lado, se observa una considerable disminución de la actividad de la enzima en el estado adsorbido, indicando que la superficie perturba la estructura tridimensional de la proteína. La actividad de la DAAO adsorbida también depende del pH, la mejor respuesta se observa a pH cercanos al PIE (7) de la enzima. Las determinaciones realizadas con el sistema FIA-amperométrico permiten obtener valores que siguen la tendencia de los resultados obtenidos por espectroscopía Uv-vis. En consecuencia, ambas técnicas resultan viables para caracterizar la actividad enzimática. La actividad enzimática de la DAAO en solución acuosa depende del pH y aumenta ligeramente con la fuerza iónica. La mayor actividad se encontró a pH 8,5, tal como se ha informado utilizando otros métodos de determinación [Boselli, A., et al Biochimie 89 (2007) 360e368]. Por otro lado, se observa una considerable disminución de la actividad de la enzima en el estado adsorbido, indicando que la superficie perturba la estructura tridimensional de la proteína. La actividad de la DAAO adsorbida también depende del pH, la mejor respuesta se observa a pH cercanos al PIE (7) de la enzima. Las determinaciones realizadas con el sistema FIA-amperométrico permiten obtener valores que siguen la tendencia de los resultados obtenidos por espectroscopía Uv-vis. En consecuencia, ambas técnicas resultan viables para caracterizar la actividad enzimática. a-cetoácidos. La presencia de D-aminoácidos en fluidos cerebrales ha sido relacionada con diferentes desordenes mentales. Además, estos aminoácidos se utilizan como marcadores para determinar la actividad bacteriana y los procesos de fermentación en productos alimenticios. Por lo tanto, el desarrollo de una herramienta analítica para la detección y cuantificación de D-aminoácidos permitirá no sólo un mejor diagnóstico de enfermedades sino también una adecuada estrategia para determinar calidad y origen de alimentos. Una de las vías más eficiente para lograr alta especificidad y sensibilidad en los métodos de detección, es la adsorción (química o física) de una biomolécula (DAAO) sobre una superficie, para que actúe como el elemento de reconocimiento de un determinado analito (D-aminoácidos) presente en la muestra. El presente trabajo tiene como objetivo caracterizar la actividad enzimática de la DAAO, tanto en solución acuosa como adsorbida, para determinar las condiciones de pH y fuerza iónica óptimos que permitan mantener la capacidad de reconocimiento de la enzima sobre la superficie. La actividad de la enzima se analizó a través de la detección amperométrica del producto de reacción, H2O2, utilizando Análisis por Inyección en Flujo (FIA) en función del pH (5, 7 y 8,5) y de la fuerza iónica (5mM y 100mM). Se trabajó aplicando un valor de potencial constante de 0,8 V vs electrodo de Ag/AgCl, a temperatura ambiente utilizando D-alanina como sustrato. Los resultados obtenidos con el método electroquímico se compararon con la actividad determinada para Espectroscopía UVvisible. La actividad enzimática de la DAAO en solución acuosa depende del pH y aumenta ligeramente con la fuerza iónica. La mayor actividad se encontró a pH 8,5, tal como se ha informado utilizando otros métodos de determinación [Boselli, A., et al Biochimie 89 (2007) 360e368]. Por otro lado, se observa una considerable disminución de la actividad de la enzima en el estado adsorbido, indicando que la superficie perturba la estructura tridimensional de la proteína. La actividad de la DAAO adsorbida también depende del pH, la mejor respuesta se observa a pH cercanos al PIE (7) de la enzima. Las determinaciones realizadas con el sistema FIA-amperométrico permiten obtener valores que siguen la tendencia de los resultados obtenidos por espectroscopía Uv-vis. En consecuencia, ambas técnicas resultan viables para caracterizar la actividad enzimática. La actividad enzimática de la DAAO en solución acuosa depende del pH y aumenta ligeramente con la fuerza iónica. La mayor actividad se encontró a pH 8,5, tal como se ha informado utilizando otros métodos de determinación [Boselli, A., et al Biochimie 89 (2007) 360e368]. Por otro lado, se observa una considerable disminución de la actividad de la enzima en el estado adsorbido, indicando que la superficie perturba la estructura tridimensional de la proteína. La actividad de la DAAO adsorbida también depende del pH, la mejor respuesta se observa a pH cercanos al PIE (7) de la enzima. Las determinaciones realizadas con el sistema FIA-amperométrico permiten obtener valores que siguen la tendencia de los resultados obtenidos por espectroscopía Uv-vis. En consecuencia, ambas técnicas resultan viables para caracterizar la actividad enzimática. 2O2, utilizando Análisis por Inyección en Flujo (FIA) en función del pH (5, 7 y 8,5) y de la fuerza iónica (5mM y 100mM). Se trabajó aplicando un valor de potencial constante de 0,8 V vs electrodo de Ag/AgCl, a temperatura ambiente utilizando D-alanina como sustrato. Los resultados obtenidos con el método electroquímico se compararon con la actividad determinada para Espectroscopía UVvisible. La actividad enzimática de la DAAO en solución acuosa depende del pH y aumenta ligeramente con la fuerza iónica. La mayor actividad se encontró a pH 8,5, tal como se ha informado utilizando otros métodos de determinación [Boselli, A., et al Biochimie 89 (2007) 360e368]. Por otro lado, se observa una considerable disminución de la actividad de la enzima en el estado adsorbido, indicando que la superficie perturba la estructura tridimensional de la proteína. La actividad de la DAAO adsorbida también depende del pH, la mejor respuesta se observa a pH cercanos al PIE (7) de la enzima. Las determinaciones realizadas con el sistema FIA-amperométrico permiten obtener valores que siguen la tendencia de los resultados obtenidos por espectroscopía Uv-vis. En consecuencia, ambas técnicas resultan viables para caracterizar la actividad enzimática.