Diseño y optimización de superficies de biorreconocimiento

LAURA VALENTI; ANDREA SMANIA; CARLOS ARGARAÑA; ROBERTO TORRESI; CARLOS DE PAULI; CARLA GIACOMELLI

Salta, Argentina

Congreso; XVI Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica; 2009

AAIFQ

Diseño y optimización de superficies de biorreconocimiento Laura Valentia, Andrea Smaniab, Carlos Argarañab, Roberto Torresic, Carlos De Paulia, Carla Giacomellia a INFIQC – Dpto. de Fisicoquímica. Facultad de Cs. Químicas. Univ. Nac. Córdoba.a, Andrea Smaniab, Carlos Argarañab, Roberto Torresic, Carlos De Paulia, Carla Giacomellia a INFIQC – Dpto. de Fisicoquímica. Facultad de Cs. Químicas. Univ. Nac. Córdoba.a a INFIQC – Dpto. de Fisicoquímica. Facultad de Cs. Químicas. Univ. Nac. Córdoba.INFIQC – Dpto. de Fisicoquímica. Facultad de Cs. Químicas. Univ. Nac. Córdoba. b CIQUIBIC – Dpto. de Qca. Biológica. Facultad de Cs. Químicas. Univ. Nac. Córdoba.CIQUIBIC – Dpto. de Qca. Biológica. Facultad de Cs. Químicas. Univ. Nac. Córdoba. c Dpto. de Química Fundamental. Instituto de Química. Universidad de San Pablo. valenti@fcq.unc.edu.ar En el desarrollo de un inmunoensayo, es necesario que la proteína que actuará como elemento de reconocimiento (antígeno o anticuerpo) interaccione con la superficie de manera fuerte y estable, sin sufrir pérdida de la actividad biológica. Esto determina el éxito del evento de biorreconocimiento superficial. Para alcanzar estos objetivos, se puede trabajar en condiciones en que se induce la interacción química de la proteína con la superficie y se minimiza la interacción física. Para ello, es necesario contar con proteínas y superficies modificadas de manera tal que se pueda inducir la interacción química entre ambas partes. En este sentido, se modifica genéticamente la estructura primaria de la proteína fusionando seis residuos de Histidina en el extremo N- terminal. Este hexapéptido le confiere a la proteína una alta afinidad por los cationes metálicos. Por otra parte, es necesario obtener sustratos modificados que presenten iones Ni(II) inmovilizados sobre la superficie. En consecuencia, la proteína interacciona de manera específica con los iones Ni(II) superficiales vía el hexapéptido. El objetivo de este trabajo es estudiar el proceso de adsorción física y química de un antígeno recombinante del Trypanosoma cruzi (His6-H49) sobre superficies modificadas de Sílica, Sílica/NTA y Sílica/NTA/Ni(II) mediante Reflectometría a pH 8,0. También se evalúa el proceso de desorción con buffer en función del grado de cubrimiento, con surfactantes (SDS, CTAB y Tween 20) y con moléculas que compiten específicamente por los iones Ni(II) superficiales (Histidina e Imidazol). La superficie biofuncional que expone el antígeno His6-H49 puede ser aplicada en el desarrollo de inmunoensayos en fase sólida para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas. La proteína His6-H49 se adsorbe sobre los sustratos de Sílica modificados y sin modificar. En condiciones en que la proteína y la superficie están cargadas negativamente, la proteína se adsorbe sobre las superficies hidrofílicas de Sílica e hidrofóbicas de Sílica/NTA debido a su baja cohesión interna. En consecuencia, la interacción proteína-superficie da lugar a un proceso de relajación que ocurre en la misma escala de tiempo que el proceso de adsorción. La estructura de la película adsorbida en el estado final y la actividad biológica superficial dependen del tiempo y espacio disponibles para la relajación. Si bien la interacción física con la superficie no se elimina con surfactantes, una importante fracción se lava mediante el agregado de NaCl 0,2 M. Sobre la superficie de Sílica/NTA/Ni(II), la adsorción ocurre en dos etapas: en la primera de ellas, la proteína se adsorbe físicamente, mientras que en la segunda, la proteína se reorienta para formar complejo con los iones Ni(II) de la superficie. En este caso, la primera etapa no conduce a rearreglos estructurales en la His6-H49. La fracción adsorbida químicamente, interacciona con la superficie a través de los residuos de Histidina presentes en el extremo N- terminal. Además, esta fracción se puede eliminar parcialmente mediante el lavado con Histidina o Imidazol. De esta manera, se logra una adsorción fuerte y estable del antígeno y se espera que la actividad biológica se mantenga intacta sobre la superficie.Dpto. de Química Fundamental. Instituto de Química. Universidad de San Pablo. valenti@fcq.unc.edu.ar En el desarrollo de un inmunoensayo, es necesario que la proteína que actuará como elemento de reconocimiento (antígeno o anticuerpo) interaccione con la superficie de manera fuerte y estable, sin sufrir pérdida de la actividad biológica. Esto determina el éxito del evento de biorreconocimiento superficial. Para alcanzar estos objetivos, se puede trabajar en condiciones en que se induce la interacción química de la proteína con la superficie y se minimiza la interacción física. Para ello, es necesario contar con proteínas y superficies modificadas de manera tal que se pueda inducir la interacción química entre ambas partes. En este sentido, se modifica genéticamente la estructura primaria de la proteína fusionando seis residuos de Histidina en el extremo N- terminal. Este hexapéptido le confiere a la proteína una alta afinidad por los cationes metálicos. Por otra parte, es necesario obtener sustratos modificados que presenten iones Ni(II) inmovilizados sobre la superficie. En consecuencia, la proteína interacciona de manera específica con los iones Ni(II) superficiales vía el hexapéptido. El objetivo de este trabajo es estudiar el proceso de adsorción física y química de un antígeno recombinante del Trypanosoma cruzi (His6-H49) sobre superficies modificadas de Sílica, Sílica/NTA y Sílica/NTA/Ni(II) mediante Reflectometría a pH 8,0. También se evalúa el proceso de desorción con buffer en función del grado de cubrimiento, con surfactantes (SDS, CTAB y Tween 20) y con moléculas que compiten específicamente por los iones Ni(II) superficiales (Histidina e Imidazol). La superficie biofuncional que expone el antígeno His6-H49 puede ser aplicada en el desarrollo de inmunoensayos en fase sólida para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas. La proteína His6-H49 se adsorbe sobre los sustratos de Sílica modificados y sin modificar. En condiciones en que la proteína y la superficie están cargadas negativamente, la proteína se adsorbe sobre las superficies hidrofílicas de Sílica e hidrofóbicas de Sílica/NTA debido a su baja cohesión interna. En consecuencia, la interacción proteína-superficie da lugar a un proceso de relajación que ocurre en la misma escala de tiempo que el proceso de adsorción. La estructura de la película adsorbida en el estado final y la actividad biológica superficial dependen del tiempo y espacio disponibles para la relajación. Si bien la interacción física con la superficie no se elimina con surfactantes, una importante fracción se lava mediante el agregado de NaCl 0,2 M. Sobre la superficie de Sílica/NTA/Ni(II), la adsorción ocurre en dos etapas: en la primera de ellas, la proteína se adsorbe físicamente, mientras que en la segunda, la proteína se reorienta para formar complejo con los iones Ni(II) de la superficie. En este caso, la primera etapa no conduce a rearreglos estructurales en la His6-H49. La fracción adsorbida químicamente, interacciona con la superficie a través de los residuos de Histidina presentes en el extremo N- terminal. Además, esta fracción se puede eliminar parcialmente mediante el lavado con Histidina o Imidazol. De esta manera, se logra una adsorción fuerte y estable del antígeno y se espera que la actividad biológica se mantenga intacta sobre la superficie.Trypanosoma cruzi (His6-H49) sobre superficies modificadas de Sílica, Sílica/NTA y Sílica/NTA/Ni(II) mediante Reflectometría a pH 8,0. También se evalúa el proceso de desorción con buffer en función del grado de cubrimiento, con surfactantes (SDS, CTAB y Tween 20) y con moléculas que compiten específicamente por los iones Ni(II) superficiales (Histidina e Imidazol). La superficie biofuncional que expone el antígeno His6-H49 puede ser aplicada en el desarrollo de inmunoensayos en fase sólida para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas. La proteína His6-H49 se adsorbe sobre los sustratos de Sílica modificados y sin modificar. En condiciones en que la proteína y la superficie están cargadas negativamente, la proteína se adsorbe sobre las superficies hidrofílicas de Sílica e hidrofóbicas de Sílica/NTA debido a su baja cohesión interna. En consecuencia, la interacción proteína-superficie da lugar a un proceso de relajación que ocurre en la misma escala de tiempo que el proceso de adsorción. La estructura de la película adsorbida en el estado final y la actividad biológica superficial dependen del tiempo y espacio disponibles para la relajación. Si bien la interacción física con la superficie no se elimina con surfactantes, una importante fracción se lava mediante el agregado de NaCl 0,2 M. Sobre la superficie de Sílica/NTA/Ni(II), la adsorción ocurre en dos etapas: en la primera de ellas, la proteína se adsorbe físicamente, mientras que en la segunda, la proteína se reorienta para formar complejo con los iones Ni(II) de la superficie. En este caso, la primera etapa no conduce a rearreglos estructurales en la His6-H49. La fracción adsorbida químicamente, interacciona con la superficie a través de los residuos de Histidina presentes en el extremo N- terminal. Además, esta fracción se puede eliminar parcialmente mediante el lavado con Histidina o Imidazol. De esta manera, se logra una adsorción fuerte y estable del antígeno y se espera que la actividad biológica se mantenga intacta sobre la superficie.6-H49 puede ser aplicada en el desarrollo de inmunoensayos en fase sólida para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas. La proteína His6-H49 se adsorbe sobre los sustratos de Sílica modificados y sin modificar. En condiciones en que la proteína y la superficie están cargadas negativamente, la proteína se adsorbe sobre las superficies hidrofílicas de Sílica e hidrofóbicas de Sílica/NTA debido a su baja cohesión interna. En consecuencia, la interacción proteína-superficie da lugar a un proceso de relajación que ocurre en la misma escala de tiempo que el proceso de adsorción. La estructura de la película adsorbida en el estado final y la actividad biológica superficial dependen del tiempo y espacio disponibles para la relajación. Si bien la interacción física con la superficie no se elimina con surfactantes, una importante fracción se lava mediante el agregado de NaCl 0,2 M. Sobre la superficie de Sílica/NTA/Ni(II), la adsorción ocurre en dos etapas: en la primera de ellas, la proteína se adsorbe físicamente, mientras que en la segunda, la proteína se reorienta para formar complejo con los iones Ni(II) de la superficie. En este caso, la primera etapa no conduce a rearreglos estructurales en la His6-H49. La fracción adsorbida químicamente, interacciona con la superficie a través de los residuos de Histidina presentes en el extremo N- terminal. Además, esta fracción se puede eliminar parcialmente mediante el lavado con Histidina o Imidazol. De esta manera, se logra una adsorción fuerte y estable del antígeno y se espera que la actividad biológica se mantenga intacta sobre la superficie.6-H49 se adsorbe sobre los sustratos de Sílica modificados y sin modificar. En condiciones en que la proteína y la superficie están cargadas negativamente, la proteína se adsorbe sobre las superficies hidrofílicas de Sílica e hidrofóbicas de Sílica/NTA debido a su baja cohesión interna. En consecuencia, la interacción proteína-superficie da lugar a un proceso de relajación que ocurre en la misma escala de tiempo que el proceso de adsorción. La estructura de la película adsorbida en el estado final y la actividad biológica superficial dependen del tiempo y espacio disponibles para la relajación. Si bien la interacción física con la superficie no se elimina con surfactantes, una importante fracción se lava mediante el agregado de NaCl 0,2 M. Sobre la superficie de Sílica/NTA/Ni(II), la adsorción ocurre en dos etapas: en la primera de ellas, la proteína se adsorbe físicamente, mientras que en la segunda, la proteína se reorienta para formar complejo con los iones Ni(II) de la superficie. En este caso, la primera etapa no conduce a rearreglos estructurales en la His6-H49. La fracción adsorbida químicamente, interacciona con la superficie a través de los residuos de Histidina presentes en el extremo N- terminal. Además, esta fracción se puede eliminar parcialmente mediante el lavado con Histidina o Imidazol. De esta manera, se logra una adsorción fuerte y estable del antígeno y se espera que la actividad biológica se mantenga intacta sobre la superficie.6-H49. La fracción adsorbida químicamente, interacciona con la superficie a través de los residuos de Histidina presentes en el extremo N- terminal. Además, esta fracción se puede eliminar parcialmente mediante el lavado con Histidina o Imidazol. De esta manera, se logra una adsorción fuerte y estable del antígeno y se espera que la actividad biológica se mantenga intacta sobre la superficie. Agradecimientos: Los autores agradecen a CONICET, SECyT-UNC, FONCyT, CAPES-SPU y al Laboratorio Nacional de Luz Sincrotron, Campinas, Brasil por el apoyo económico. LEV agradece a CONICET por la beca obtenida.