INFIQC   05475
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN FISICO- QUIMICA DE CORDOBA
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Aplicación de Sondas Plasmónicas Generadas por Bioconjugación a la Identificación y Cuantificación de Receptores en Membranas Celulares
Autor/es:
JUAN C. FRAIRE, M. LUJAN MASSERONI, IGNACIO JAUSORO, ALFREDO CÁCERES, ALBERTO M. DIAZ AÑEL Y EDUARDO A. CORONADO
Lugar:
Carlos Paz, Córdoba.
Reunión:
Encuentro; NanoCórdoba 2012; 2012
Institución organizadora:
NanoCórdoba
Resumen:
Las propiedades ópticas de nanopartículas (NPs) de metales nobles, son objeto de numerosas investigaciones en el campo de la biología molecular debido al potencial que presentan este tipo de estructuras para ser utilizadas en espectroscopías ultrasensibles, y en particular en el campo emergente de la biospectroscopia. A su vez, este tipo de nanoestructuras pueden ser funcionalizadas con compuestos biológicos teniendo el potencial de ser utilizadas como sensores bio(químicos) ópticos ultrasensibles. La aplicación de la espectroscopía en el campo de la biomedicina está en pleno desarrollo ya que a diferencia de la inmunomarcación y las técnicas de inmunoensayo, la utilización de sondas plasmónicas permite detectar de forma simultánea una gran variedad de biomoléculas. La utilización de NPs de oro y plata para detectar la presencia de una determinada especie por medio de espectroscopia ultrasensible como espectroscopia Raman incrementada por superficie (SERS), y, en combinación con técnicas de microscopia electrónica y óptica confocal permite determinar distribuciones de una determinada biomoléculas en la superficie celular. Este trabajo tiene como objetivo el diseño de una sonda plasmónica por medio de bioconjugación de NPs de oro que permita determinar la expresión y distribución de proteínas en superficies biológicas mediante técnicas ópticas (SERS y microscopia confocal) y microscopia electrónica de barrido (SEM). El diseño de las sondas plasmónicas consiste en la funcionalización superficial de NPs de oro mediante el sistema Biotina-Estreptavidina (STV) la cual a su vez permite realizar experimentos de inmunocitoquímica debido a la presencia de un fluoróforo en la proteína. La relación entre biotina y STV utilizada fue 1:1 dejando 3 sitios vacantes en la proteína a través de los cuales puede interaccionar con algún anticuerpo biotinilado adherido a la superficie celular. Estas sondas plasmónicas fueron luego aplicadas en ensayos con modelos biológicos en los cuales se sobrexpresó un receptor de membrana y se compararon las tendencias observadas con ensayos en condiciones donde la expresión o la distribución del receptor se encuentra alterada. Como modelo biológico se utilizaron dos tipos de células: CHO-K1 (línea celular) y neuronas de hipocampo de 14 DIV (días in vitro). En ambos tipos celulares, se sobrexpresó el receptor mGluR1 (receptor metabotrópico de glutamato de siete pasos transmembrana) en el caso control, y mGluR1 conjuntamente con la mutante dominante negativa PKD1-kd (proteína quinasa D1 kinase dead) asociada a la membrana del aparato de Golgi en donde esta regula diferentes procesos según el tipo celular. En el caso de las células CHO-K1 se observó mediante SERS, microscopia confocal y SEM, que la distribución de mGluR1 sobre la membrana plasmática es homogénea para el caso control, a diferencia de las tendencias observadas para la sobreexpresión conjunta con PKD1-kd en donde se observa una disminución significativa de la inserción en membrana. Este hecho se refleja en la disminución de las señales de fluorescencia y SERS así como también en la disminución de la densidad superficial de NPs en las imágenes SEM. Este fenómeno se debe a que la proteína PKD1 participa en la fisión de vesículas cargadas con el receptor que salen del aparato de Golgi y se fusionan a la membrana plasmática, mientras que cuando se expresa una mutante PKD1-kd se inhibe la fisión de vesículas en esta organela y por consiguiente disminuye la llegada de receptores a la membrana. En el caso de las neuronas donde el receptor mGluR1 interviene en las sinapsis excitatorias mediadas por glutamato, y en las cuales PKD1 regula el sorting de proteínas de membrana dendrítica, se logró evaluar mediante un índice de polaridad (relación entre la intensidad de señal en dendritas y la Intensidad de señal en axon) la distribución de mGluR1 en el dominio somato-dendritico y el axonal en ausencia o en presencia de la mutante PKD1-kd. Utilizando estas plataformas, a través de microscopia confocal y determinación de la densidad superficial de partículas por SEM, se pudo observar la variación de la distribución (missorting) de mGluR1 en presencia de PKD1-kd que se correlaciona con la disminución del índice de polaridad. De esta manera mostramos como la utilización de sondas plasmónicas en combinación con técnicas ópticas (SERS y fluorescencia) y técnicas de microscopia electrónica permite resolver tanto la presencia de un determinado compuesto biológico como así también su distribución superficial en la membrana celular.