Diseño y caracterización de un aptasensor con detección dual optica y electroquimica (E-SPR) para la cuantificación de proteínas

Y. JALIT; F. A. GUTIERREZ; G. DUBACHEVA; L. COCHE-GUÉRENTE; E. DEFRANCQ; P. LABBÉ; G. A. RIVAS; M. C. RODRÍGUEZ

Santa Fe

Congreso; 6º Congreso de Química Analitica; 2011

Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas y Facultad de Ingenieria Química-Universidad Nacional del Litoral

El descubrimiento de los aptámeros en 1990[1] ha contribuido ampliamente al desarrollo de un nuevo grupo de biosensores de afinidad, los aptasensores. El principal interés del uso de estas unidades de reconocimiento molecular radica en las conocidas ventajas de los aptámeros sobre otros ligandos proteicos (anticuerpos)[2]. Los aptámeros son ácidos nucleicos sintéticos de simple hebra (ssADN o ARN) que exhiben una fuerte y específica unión por afinidad con un amplio rango de “blancos”: cationes mono y divalentes, moléculas pequeñas, biomacromoléculas y células. La combinación de las propiedades específicas de los aptámeros con los ventajosos métodos electroquímicos convierte a los aptasensores electroquímicos en útiles herramientas de diagnóstico.    Este trabajo describe una novedosa estrategia para el desarrollo de un aptasensor para la detección de proteínas empleando trombina como modelo de la interacción aptámero-proteína. El aptámero anti-trombina es una secuencia de ADN de simple hebra de 15 bases específica para trombina humana, enzima que participa en el proceso de coagulación sanguínea. El biosensor fue obtenido modificando superficies de oro mediante adsorción de ácido 4-mercapto benzoico, seguido de la inmovilización covalente de estreptavidina. En cada etapa se evaluaron las condiciones operativas para el óptimo desempeño del aptasensor por medio de resonancia del plasmón superficial (SPR), voltamperometría cíclica y espectroscopía de impedancia faradaica. Las condiciones óptimas de inmovilización del aptámero por enlace covalente y la posterior formación del complejo de bioafinidad trombina-aptasensor se evaluaron por SPR a través los cambios de reflectividad relacionados con el crecimiento de la película. En cuanto a la caracterización electroquímica se estudió la formación de la capa de biorreconocimiento mediante de los cambios de la señal voltamperométrica de un indicador rédox (ferricianuro de potasio) y por cambios en la resistencia a la transferencia de carga (Rtc) de una sonda electroquímica (ferricianuro/ferrocianuro de potasio). De este modo, se observó que la Rtc aumenta con el tiempo de interacción aptámero biotinilado-estreptavidina, seleccionándose un tiempo óptimo de 60 min para la obtención de la capa de reconocimiento del aptasensor. En términos de la performance analítica es posible la detección de trombina en niveles de picomoles. Un apropiado control de las condiciones de trabajo permitió optimizar la interacción aptasensor-proteína aún en presencia de interferentes. Asi, la asociación de las propiedades de reconocimiento molecular del aptámero con transductores electroquímicos permitió obtener un aptasensor anti-trombina altamente sensible y selectivo, abriendo las puertas al desarrollo de nuevas metodologías para la detección dual óptica-electroquímica de proteínas. [1] Ellington, A. D.; Szostak, J. W. Nature 346 (1990) 818 [2] James, W. Encyclopedia of Analitycal Chemistry Ed. Meyers, R. A. Wiley (2000)