Caracterización de la Actividad Enzimática de D-Aminoácido Oxidasa de diferentes orígenes

HERRERA, ELISA G.; GIACOMELLI, CARLA E.; VALDÉZ, JAVIER

Córdoba

Congreso; XVII Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica; 2011

Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica

CARACTERIZACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE D-AMINOACIDO OXIDASA DE DIFERENTES ORÍGENES.     Elisa G. Herreraa, Javier Valdezb; Carla E. Giacomellia   aINFIQC. Departamento de Fisicoquímica. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Córdoba. 5000. Córdoba. Argentina. mail: eherrera@fcq.unc.edu.ar bCIQUIBIQC. Departamento de Química Biológica Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Córdoba. 5000. Córdoba. Argentina.     La D-aminoácido oxidasa (DAAO) cataliza la conversión de D-aminoácidos a sus correspondientes a-cetoácidos. La enzima proveniente de levadura, RgDAAO, difiere de la enzima de origen animal, pkDAAO, en aspectos importantes tales como la eficiencia catalítica, especificidad de sustrato, estabilidad, mecanismo de unión sustrato-enzima, modo y efectividad de unión al cofactor. Ambas enzimas pueden ser utilizadas como elemento de reconocimiento de superficies biofuncionales. Un diseño adecuado de estas superficies implica promover una interacción fuerte y estable con orientación preferencial del elemento de reconocimiento sobre el sustrato. Por lo que es necesario modificar el sustrato, el elemento de reconocimiento o ambos. Una estrategia para modificar el elemento de reconocimiento, es utilizar técnicas recombinantes para fusionar un hexapéptido de Histidinas ((His)6) en el extremo N- terminal de la enzima. Siguiendo esta estrategia, se expresa una proteína que presenta una modificación química tal que permite una interacción fuerte y estable con sitios Ni(II) superficiales. El presente trabajo tiene como objetivo estudiar y comparar los parámetros cinéticos que caracterizan a la actividad enzimática de  pkDAAO y RgDAAO-(His)6 en función del pH, para evaluar la implementación de la RgDAAO-(His)6 como elemento de bio-reconocimiento. La tabla 1 muestra que la RgDAAO-(His)6 presenta actividad enzimática a todos los valores de pH estudiados, aún a concentraciones más bajas que las concentraciones mínimas en las que se puede medir actividad para pkDAAO. Los parámetros cinéticos, Km y Vmax, de ambas enzimas dependen fuertemente del pH. La mayor actividad se observa, en ambos casos, a pH 8,5. La actividad de ambas enzimas disminuye drásticamente a pH 5,0 indicando probables modificaciones en su estructura nativa. Km es menor para RgDAAO-(His)6, indicando que esta enzima presenta mayor afinidad por el sustrato. Vmax es significativamente mayor para RgDAAO-(His)6, lo que evidencia mayor eficiencia catalática. La RgDAAO-His6 aparece como una alternativa viable para ser usada como elemento de bio-reconocimiento. E.G.H. agradece a CONICET la beca otorgada. Este trabajo fue financiado por CONICET, SeCyT-UNC, FONCyT.