PROPIEDADES DE MATRICES POLIMÉRICAS EMPLEADAS COMO SOPORTES ENZIMÁTICOS

MARCELO RICARDO ROMERO; TOMAS ENRIQUE BENAVIDEZ; FERNANDO GARAY; ANA M. BARUZZI

Costa Roca

Simposio; XII Simposio Lationoamericano de Polímeros (SLAP 2010) y el X Congreso Iberoamericano de Polímeros (CIP 2010); 2010

La inmovilización de elementos de bio-reconocimiento es un proceso del cual depende, en gran medida, el funcionamiento de los biosensores. Estos dispositivos son muy útiles para la detección de analitos de manera específica y rápida, (1,2). En algunos biosensores amperométricos enzimáticos, la enzima se incorpora en una matriz polimérica que se coloca entre dos membranas porosas formando un sandwich sobre la superficie de un electrodo, que actúa como transductor electroquímico (3). La matriz polimérica constituye una parte fundamental en la estructura del biosensor ya que el entorno químico que interacciona con la biomolécula puede alterar positiva o negativamente su actividad natural (4). Se ha demostrado que las matrices hidrofilicas son las que otorgan ambientes más propicios, mejorando la retención de actividad enzimática (5), lo cual se manifiesta en una mejor respuesta analítica del sensor. Es posible combinar polímeros y encontrar mezclas con las ventajas de ambos obteniéndose biosensores de excelentes propiedades analíticas (5-7). Si la inmovilización de la enzima es por entrecruzamiento, éste debe ser controlado con precisión debido al frágil equilibrio existente entre la efectiva retención de actividad y la desnaturalización (4). En este trabajo se estudian las propiedades fisicoquímicas de matrices poliméricas utilizadas como soporte de inmovilización y su relación con la respuesta del sensor. Se analizan mezclas de polímeros naturales y sintéticos tales como mucina, albúmina y quitosán. La mucina es una glicoproteína que se comporta como polielectrolito aniónico debido a la presencia del ácido siálico y de grupos sulfato (8); la albúmina es una proteína muy utilizada en inmovilización y el quitosan es un hidrogel cuya naturaleza química permite que la carga de los grupos amino en las cadenas poliméricas puedan ser controladas con el pH (9). Las enzimas a inmovilizar fueron seleccionadas en función del pH de máxima actividad y por la naturaleza química del analito correspondiente. La enzima oxalato oxidasa tiene un pH óptimo de catálisis de 2,85 y el analito oxalato tiene carga negativa. En tanto que las enzimas lactato y glucosa oxidasa tienen un pH óptimo de 7 y sus correspondientes analitos, el lactato y la glucosa tienen carga negativa y neutra respectivamente. Se evaluó el coeficiente de partición (Kd) y la permeabilidad del analito en la matriz que dan cuenta de la disponibilidad de sustrato para la reacción enzimática. También se evaluó el hinchamiento y las propiedades reológicas de las matrices como una medida del ambiente hidrofílico que rodea a la enzima. En el caso de las matrices de mucina /quitosán para el electrodo de oxalato se observó una disminución en la señal analítica con el aumento del porcentaje de quitosán. Por el contrario, para el sensor de glucosa la sensibilidad aumenta al aumentar el porcentaje de quitosán (6). Los resultados se resumen en el siguiente cuadro. Tabla 1 Efecto del contenido de quitosán sobre las propiedades fisicoquímicas de las matrices mucina/quitosán Efecto de Aumento de Quitosán Biosensor Oxalato Glucosa Sensibilidad ↓ ↑ Disponibilidad ↓ ↑ Kd ↑ ↑ P ↓ ↑ Ambiente hidrofílico ↓ ≈ cte Estos resultados indican la importancia de la disponibilidad de sustrato en la respuesta analítica. La fuerte interacción entre la carga negativa de oxalato y las cargas positivas de quitosán determinaron la escasa permeabilidad del analito. Por otro lado, al ser la glucosa una molécula neutra se encontraron valores elevados de permeabilidad, lo cual sumado al aumento del Kd determinaron la mayor sensibilidad observada en quitosán 100% (10). Esto fue corroborado por experimentos realizados en presencia de iones sulfato y cloruro, Se desarrolló también un modelo que describe la respuesta de estos sensores en curvas I vs. t (corriente vs. tiempo) y curvas de calibración I vs. C (corriente vs. concentración), que permite dar cuenta de la influencia de algunos de estos parámetros fisicoquímicos en la respuesta analítica. El modelo considera que la respuesta del sensor es el resultado de varias etapas: la difusión del analito desde la solución a la matriz por gradiente de concentración, la reacción específica en la matriz con la enzima, la difusión de los productos hacia la solución y hacia el electrodo donde se produce la reacción electroquímica cuya corriente se registra.