Estrés oxidativo en bacterias: Posible mecanismo de acción de nanopartículas de plata biosintetizadas.

MA QUINTEROS, V CANO ARISTIZÁBAL, P DALMASSO, MG PARAJE, PL PÁEZ.

Rosario

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano y Argentino de Microbiología. ALAM-CAM 2016.; 2016

ALAM-CAM 2016.

Las  nanopartículas  de  plata  (NPsAg)  han  demostrado  ser  eficaces  contra  las  bacterias  resistentes  a  los  antibióticos  y  sus  propiedades antimicrobianas pueden ser atribuidas a que podrían causar especies reactivas de oxígeno (ERO). El estrés oxidativo es una condición producida por las altas concentraciones intracelulares de ERO, las cuales las células microbianas son incapaces de neutralizar, lo que podría resultar en la muerte  de  los  microorganismos.  El  objetivo  de  este  trabajo  es  contribuir  a  la  comprensión  del  mecanismo  de  acción  de  NPsAg  como generadores  de  daño  oxidativo en  diferentes géneros  bacterianos mediante  la evaluación  de estrés  oxidativo  y  nitrosativo.  La  hipótesis  que consideramos es que las NPsAg podrían interactuar con la membrana bacteriana, alterando el metabolismo respiratorio, causando una rápida generación  de  radicales  libres  por  reacciones  redox,  llevando  a  la  célula  a  una  condición  de  estrés  oxidativo  que  conduciría  a  la  muerte bacteriana.  Las  NPsAg  fueron  obtenidas  por  biosíntesis  extracelular  a  partir  del  sobrenadante  del  cultivo  de  P.  aeruginosa  ATCC  27853.  El control  de  la  síntesis  se  llevó  a  cabo  por  espectrofotometría  Uv‐Vis  y  por  microscopia  de  transmision  (TEM).La  susceptibilidad  a  las nanopartículas biosintetizadas  se determinó mediante el método de macrodilución en  tubos,  calculando la  concentración inhibitoria mínima (CIM)  y  la  concentración  bactericida  mínima  (CBM).  Las  cepas  bacterianas  estudiadas  fueron  S.  aureus  ATCC  29213,  E.coli  ATCC  25922  y  P. aeruginosa  ATCC  27853.  La  generación  de  ERO  producidas  por  la  acción  de  las  NPsAg  fue  determinada  por  espectrofluorometría  y  por microscopía de  fluorescencia utilizando como monitor de ERO a la sonda H2‐DCFDA. La cuantificación de las especies reactivas del nitrógeno (ERN)  se  realizó mediante la  reacción  de  la Griess.  Las  nanopartículas  biosintetizadas exhibieron  un  pico  de absorción alrededor  de  390  nm característico  de  NPsAg.  La  TEM  confirmo  que  presentaban  un  tamaño  de  30  nm  y  de  forma  esferoidal.  Los  ensayos  de  susceptibilidad confirmaron  la  actividad  antimicrobiana  de  las  NPsAg  biosintetizadas  frente  a  las  cepas  estudiadas.  La  CIM  y  la  CBM  determinadas  se encontraban entre  0,016‐0,203 pM. La generación  de ERO inducida por NPsAg  fue  tiempo y concentración dependiente en las  tres especies bacterianas  estudiadas.  Estos  resultados  fueron  confirmados  por  microscopía  de  fluorescencia.  Los  niveles  de  ERN  fueron  tiempo  y concentración  dependientes.  Hemos  podido  demostrar  que  las  NPsAg  biosintetizadas  generan  estrés  oxidativo  en  S.  aureus,  E.  coli  y  P. aeruginosa mediado  por  el  aumento  de  las  ERO  y  una  variación  en  el  nivel  de  las  ERN.  En  base  a  lo  expuesto,  podemos  considerar  que  la formación de ERO y ERN mediada por NPsAg podrían ser parte del proceso de muerte bacteriana.