Cuantificación por Microscopia Confocal de Exploración Laser (MCEL) de la actividad antifúngica y el estrés oxidativo de un compuesto antifúngico de origen natural sobre biofilms de Candida albicans

DA SILVA, MARIA ANGEL; CABRERA, JOSE LUIS; PERALTA, MARIANA ANDREA; PARAJE, MARÍA GABRIELA; ORTEGA, MARÍA GABRIELA

Rosario

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología; 2016

Asociación Argentina de Microbiología-Asociación Latinoamericana de Microbiología

Cuantificaciónpor Microscopia Confocal de Exploración Laser (MCEL) de la actividadantifúngica y el estrés oxidativo de un compuesto antifúngico de origen naturalsobre biofilms de Candida albicans da Silva MA1,  Peralta MA2, OrtegaMG2,Cabrera JL2,Paraje MG1,Peralta MA21 CONICET,Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal (IMBIV); Cátedra deMicrobiología Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales, UniversidadNacional de Córdoba.2 CONICET,Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal (IMBIV); Universidad Nacionalde Córdoba, Facultad de Ciencias Químicas.e-mail: mari.da.silva31@gmail.com Lasinfecciones de Candida asociadas abiofilms son clínicamente relevantes dado su alta resistencia a los fármacos deuso corriente, volviéndose imprescindible la búsqueda de nuevas drogas. En estesentido, el ácido úsnico (AU), un metabolitosecundario producido por la especie de líquenes Usneaamblyoclada, ha demostrado efectos antimicrobianos en cultivosplanctónicos de diversas especies bacterianas y fúngicas. Sin embargo, suactividad sobre biofilms está menos estudiada. Nuestro grupo de trabajo hademostrado que el AU tiene actividad anti-biofilm sobre Candida albicans y que el estrés oxidativo está involucrado. Elobjetivo de este trabajo es profundizar dicho estudio cuantificando mediante MCEL elefecto de AU sobre biofilms de C.albicans evaluando el estrés oxidativo intracelular en las células sésiles. Compuesto: El AU fuepurificadopartir del extracto bencénico de líquenes del género UsneaMicroorganismos: C. albicans de origen bucal  resistente afluconazol por sobreexpresion de transportadores de eflujo de tipo CDR1, CDR2 yMDR1 (CaR)(cortesía del Dr E. White, Washington University, Seattle, EE.UU). Tratamiento ATF: Las muestrasfueron tratadas con AU 4 µg/ml.MCEL: La formación de biofilmsy el correspondiente tratamiento antifúngico serealizó sobre discos de vidrio en microplacas de 24 pocillos. Posteriormente seeliminó el sobrenadante y las muestras se tiñeron con Calcofluor White (0.05%v/v) el cual tiñe de azul la pared celular permitiendo cuantificar la biomasa. Lageneración intracelular de especies reactivas de oxigeno (EROs), se estudiómediante tinción con la sonda 2?,7?-diclorodihdrofluoresceindiacetato (DCFH-DA), la cual difunde através de la membrana, es hidrolizada a DCFH por esterasas y finalmente oxidadaal compuesto fluorescente DCF (verde) por acción de las EROs (anión superóxido).Las muestras fueron tomadas con un Microscopio Fluoview FV1000 Espectral Olympus(Olympus Latin America, Miami, FL, USA), tomando revanadas ópticas de 1,2μm. Lasimágenes fueron analizadas con el programa NIH-ImageJ y el software COMSTAT. El análisis por COMSTAT mostró unadisminución del 73% en la biomasa del biofilm tratado con AU (4.91µm3/µm2), con respectoal biofilm basal (18.39 µm3/µm2). Esto fueacompañado de una reducción en el grosor del mismo correspondiente a un 76.8% (de 21,9 a 4,81µm). En cuanto a lacuantificación del estrés oxidativo intracelular, se obtuvo un valor de 0.78±0.06 para el biofilm tratado y 0.46±0.05 para el biofilm basal. Lasimágenes muestran una co-localización evidenciada por un color turquesa,resultante de la mezcla de azul y verde. Estos resultados corroboran la actividadanti-biofilm del AU en una cepa de C.albicans resistente a FLZ, y evidencian que el estrés oxidativo estainvolucrado. Por lo tanto, alientan a seguir estudiando en profundidad elmecanismo de acción de este compuesto como posible alternativa para eltratamiento de infecciones por cepas de Candidaresistentes a azoles.