Expresión a purificación de Caltrin de rata en Escherichia coli

MIRANDA SABRINA D.; MONTI MARIELA. R.; NOVELLA M.L.; ARGARAÑA CARLOS E.; CORONEL CARLOS E.

Córdoba-Argentina

Jornada; XVII Jornadas Científicas de la Sociedad de Biología de Córdoba; 2009

Sociedad de Biología de Córdoba

Caltrin (calcium transport inhibitor), es secretada por las vesículas seminales y se une a la cabeza de espermatozoides epididimarios de rata, específicamente en la región acrosomal e inhibe la incorporación de Ca2+ extracelular  (Coronel et al., JBC 265:6854, 1992). Se demostró que inhibe la actividad de tripsina y de proteasas acrosomales, así como la liberación de enzimas presentes en el acrosoma (Winnica et al., Biol Reprod 63:42, 2000), además ejerce un efecto protector sobre el acrosoma debido a que previene la exocitosis acrosomal espontánea, sin afectar la fosfotirosinación de  proteínas que se lleva a cabo durante el  proceso de capacitación (Dematteis et al, Biol Reprod 79:493, 2008). El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método eficiente para expresar y purificar la proteína caltrin de rata en E. coli. Para ello el cDNA, obtenido a partir del ARNm de vesículas seminales mediante RT-PCR (Novella y col. 2004), fue clonado en vector pGEM T-easy y su identidad confirmada por secuenciamiento. Posteriormente se subclonó en el vector de expresión pTYB11, sistema diseñado para purificar proteínas mediante fusión al péptido de afinidad inteína, que permitió la purificación de caltrin en E. coli ER2566. Las mejores condiciones para la expresión de la proteína de fusión caltrin-inteína fueron: crecer las células hasta DO600=0,6 e inducir con IPTG concentración final 0.5 mM ON a 20ºC. La presencia de la proteína fue analizada en el sobrenadante del lisado de bacterias, por SDS-PAGE y Western blot utilizando anticuerpos específicos. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad utilizando resina de quitina y posterior liberación de caltrin por inducción de la actividad de autoclivaje de interna  con cisteína 50 mM. Con la proteína recombinante pura se realizaron ensayos para determinar su actividad. Caltrin recombinante presentó la misma actividad que la proteína nativa: reconocimiento por anticuerpos, unión en la región acrosomal de la cabeza de espermatozoides epididimarios y actividad inhibitoria de tripsina.