Remodelación de membranas lipídicas de DMPG por asociación de la proteína periférica L-BBP

DECCA, M. B.; MONTICH, G. G.

Córdoba

Taller; Nano Cordoba 2014; 2014

El objetivo general de nuestro trabajo es estudiar las interacciones de proteínas con membranas lipídicas y los mecanismos por los cuales algunas proteínas solubles pueden asociarse, penetrar o atravesar una membrana lipídica. Como modelo experimental usamos la proteína básica L-BABP interaccionando con membranas lipídicas aniónicas sintéticas en forma de liposomas unilamelares grandes (LUVs). La unión de L-BABP a membranas es de tipo periférica y está regida principalmente por interacciones electrostáticas. Las principales técnicas utilizadas en este trabajo fueron: FT-IR (espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier) para el análisis de estructura secundaria de proteínas y estado de fase de membranas lipídica; DSC (calorímetría diferencial de barrido) para estudio de transiciones de fase de la membrana lipídica; ITC (calorimetría de titulación isotérmica) para la determinación de delta H y constantes de asociación; DLS (dispersión dinámica de la luz) para la determinación del tamaño de LUVs. Nuestros resultados indican que la conformación que adquiere la proteína L-BABP en la interfase de membranas lipídicas es sensible al potencial electrostático de superficie, siendo posible modificar la conformación de L-BABP unida a membranas a partir de variaciones de fuerza iónica, composición lipídica y estado de fase de los lípidos de la membrana. De esta forma, en alta fuerza iónica, L-BABP en la interfase de membranas de POPG en estado líquido-cristalino o en membranas de DMPG en fase gel tiene una estructura secundaria de tipo nativa, mientras que unida a membranas de DMPG en fase liquido-cristalina tiene una estructura secundaria parcialmente desplegada En relación a la influencia de la proteína sobre las propiedades de la membrana lipídica, encontramos que L-BABP no modifica ni el tamaño de las vesículas ni la fluidez de membranas de POPG. En cambio, la asociación de LPABP a membranas de DMPG produce cambios complejos, tanto en tamaño de las vesículas como en el comportamiento termotrópico de los lípidos en ciertas condiciones experimentales. Utilizando calorimetría de titulación isotérmica obtuvimos información sobre la entalpía del proceso de asociación, encontrando una correlación entre la aparición de procesos endotérmicos y los eventos de remodelación de membranas, que se describen a continuación. A fin de descartar la contribución conformacional en el proceso de binding las determinaciones de ITC se realizaron con membranas de DMPG en fase gel (temperatura 16°C), donde la proteína se asocia a la membrana sin cambios de estructura secundaria. Los resultados obtenidos permiten definir dos regímenes de asociación diferentes de acuerdo a la relación lípido/proteína (L/P. En exceso de lípido (L/P mayor a 1000) la unión de la proteína no produce cambios ni en el tamaño de las vesículas ni en el compotamiento termotrópico del lípido. En estas condiciones, el delta H de asociación es exotérmico y corresponde al proceso intrínseco de asociación de la proteína a la membrana. Al aumentar la cantidad de proteína en relación al lípido detectamos disminución en el tamaño de las LUVs y modificación de los termogramas que muestran transiciones de fase poco cooperativas y desplazadas a mayor temperatura en relación a membranas de lípido puro. En estas condiciones, el delta H de asociación determinado por ITC es endotérmico y refleja la resultante de al menos dos procesos de signo opuesto: la asociación intrínseca de la proteína a la membrana (delta H negativo) y la remodelación de las membranas de DMPG (delta H positivo). La asociación de L-BABP a membranas lipídicas es un proceso complejo, que involucra cambios en la conformación de la proteína y modificación de las propiedades físicas de las membranas. A partir de las técnicas y diseños experimentales presentados en este trabajo ha sido posible separar las contribuciones individuales de los distintos procesos involucrados y calcular algunas de sus propiedades termodinámicas.