Cambios conformacionales en la proteína ReP1 inducidos por la interacción con membranas lipídicas

SALINAS, SR; GALASSI, VV; MONTICH, GG

Córdoba

Congreso; NanoCórdoba; 2014

La asociación reversible y la unión de proteínas solubles a membranas lipídicas son procesos claves en las funciones celulares. Estas interacciones proteína-membrana resultan en cambios de la actividad enzimática o en la conformación de la proteína, e influyen directamente en una gran variedad de procesos celulares: transmisión de información, procesamiento de componentes de membrana, transporte de compuestos poco solubles entre compartimentos celulares y asociación a membrana y traslocación de toxinas bacterianas, entre otros procesos. La traslocación desde el medio acuoso a la membrana resulta en un drástico cambio en el ambiente de la proteína. La interfase presenta gradientes de composición química, viscosidad, actividad de agua y fuerzas electrostáticas, ofreciendo un ambiente altamente anisotrópico en la escala de tamaño de una proteína. Esta diferencia de ambiente determina que se puedan estabilizar en la membrana diferentes conformaciones de la proteína, ejerciendo una modulación sobre su actividad biológica. La unión a la membrana y los cambios estructurales, de estabilidad y eventualmente de actividad biológica están directamente acoplados y son intrínsecamente inseparables, ya que las mismas fuerzas termodinámicas intervienen en ambos procesos. Nuestro objetivo general es estudiar el problema del plegamiento, la estabilidad y el mecanismo de interacción de proteínas solubles que se unen de manera transitoria a membranas lipídicas. En particular, utilizamos como sistema de estudio la proteína de axón de calamar ReP 1, perteneciente a la familia de proteínas de unión a ácidos grasos. Previamente, se caracterizó la estructura secundaria de la proteína mediantes ensayos biofísicos, mostrando que posee láminas beta como estructura predominante, coherente con un barril beta. La estructura cristalográfica de la proteína confirmó que ReP1 es un barril beta plano y contiene además dos segmentos alfa-hélice. Se demostró, además, que Rep-1 es una proteína que une ácidos grasos y participa en la regulación del sistema intercambiador Na(+)/Ca(2+). En ensayos preliminares de simulaciones de dinámica molecular (MD) observamos que Rep-1 se une más fuertemente a membranas aniónicas. Esta observación es avalada por experimentos de unión por filtración, donde se observó un comportamiento similar. También mediante MD, observamos que la unión electrostática puede ser mediada por una distribución de cargas global en la proteína, y no solo por dominios o parches básicos. Profundizando en los mecanismos de interacción de la proteína ReP1 con membranas, estudiamos la conformación de la proteína en solución y en presencia de lípidos aniónicos (DMPG y POPG) en función de la temperatura. Para ello usamos técnicas como FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy) y CD (circular dichroism) que nos permiten analizar y detector cambios en estructura secundaria. Mediante CD se observó que la interacción de ReP1 con DMPG induce un incremento en el porcentaje de alfa-hélice (de 18% a 30%). Con POPG también se observó un comportamiento similar, pero más sutil. En solución, el espectro FTIR de ReP1 mostró una banda a 1617 cm-1 a temperaturas mayores a la temperatura de desnaturalización de la proteína. En presencia de DMPG, esta banda no fue observada, indicando que la agregación se encuentra inhibida en la interfase. Consistentemente, los espectros de CD en presencia de ambos lípidos muestran que la proteína mantiene parte de su estructura secundaria aún a altas temperaturas. Además, observamos que este incremento de alfa-hélice ocurre a la temperatura de transición del lípido de gel a líquido-cristalino del DMPG. En conjunto, podemos concluir que un cambio conformacional ocurre en la proteína, tendiente a estabilizarla, cuando interacciona con lípidos aniónicos, y se encontraría relacionado con la transición de fase del lípido.