PRIMARY CULTURES OF CHICKEN RETINAL HORIZONTAL CELLS EXPRESS THE PHOTOPIGMENT MELANOPSIN X

MORERA L.P.; DIÁZ N M; GUIDO ME.

Córdoba

Congreso; XXVIII CONGRESO ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE INVESTIGACIÓN EN NEUROCIENCIAS; 2013

SOCIEDAD ARGENTINA DE INVESTIGACIÓN EN NEUROCIENCIAS

HIGHLY ENRICHED PRIMARY CULTURES OF CHICKEN RETINAL HORIZONTAL CELLS EXPRESS THE PHOTOPIGMENT MELANOPSIN X CULTIVOS PRIMARIOS DE RETINA DE POLLO ALTAMENTE ENRIQUECIDOS EN CÉLULAS HORIZONTALES EXPRESAN EL FOTOPIGMENTO MELANOPSINA X. Morera L.P, Díaz N.M y Guido M.E, CIQUIBIC-Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba-CONICET, 5000 Córdoba, Argentina Email: luis.p.morera@gmail.com Antecedentes y objetivos: Las células ganglionares de la retina (CGR) que expresan el fotopigmento melanopsina (OPN4) son intrínsecamente fotosensibles. En la retina de pollo han sido descriptos dos genes de OPN4, Opn4x y Opn4m. Se demostró que la expresión de Opn4m se limita solo a la capa de CGRs, mientras que Opn4x cambia a lo largo del desarrollo: al día embrionario 8 (E8) se limita a la capa en formación de CGRs y al nervio óptico, mientras que a partir del E15 aparece principalmente en células horizontales (HCs) (Verra et al., 2011). El objetivo de este trabajo fue purificar las HCs de la retina de pollo, obtener cultivos primarios altamente enriquecidos en estas células y caracterizar los mismos. Métodos: Se disgregaron retinas de embriones de pollo de E15 y se sometieron a un gradiente discontinuo de 1 al 4% de albúmina de suero bovino (BSA). Las células recolectadas de las diferentes fases se cultivaron durante 4 días y se caracterizaron por inmunoquímica y morfología celular. Las fases se examinaron con anticuerpos específicos contra Opn4x, marcadores de HCs (PROX-1, Islet-1, calretinina) y marcadores para otras poblaciones de células de la retina. Además la expresión de Prox-1 en la retina se determinó por citometría de flujo. Finalmente los cultivos primarios fueron analizados por RT-PCR. Resultados: Sólo la fracción del gradiente correspondiente al 2,5% de BSA contuvo el mayor porcentaje de HC´s. Basados en un detallado análisis morfológico se encontró que las células de esta fracción se asemejan a HCs tipo H1 y H3. La inmunoreactividad de Opn4x se observó en los cultivos de las células provenientes tanto de la fase 2,5 como de la del 3% de BSA. Es de destacar que la fase 3% contiene células que expresan el filamento neuronal de 200 kDa (NF200) y presentan procesos que se asemejan morfológicamente a los de las CGRs. El análisis por citometría de flujo demostró que un 30 % de las células en el disgregado de retina total, y un 80 % de las células de la fase 2,5 % presentan marca Prox-1 (+). El análisis por RT-PCR evidenció la presencia de transcriptos correspondientes a marcadores específicos de HCs. Conclusiones: Por medio de este método separamos selectivamente HCs y logramos cultivos altamente enriquecidos en estas células que expresan el fotopigmento OPN4x. Financiado por ANPCyT-FONCyT PICT Bicentenario 2010 Nr. 647, PICT, CONICET, SeCyT-UNC, and MinCyT of Córdoba.