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Lectinas son proteínas que reconocen específicas secuencias y conformaciones de carbohidratos. La lectina de Agaricus bisporus (ABL) ha sido descripta como una proteína que participaría en diversos procesos celulares, como los de defensa, poseyendo además una potente actividad anti-proliferativa hacia células tumorales de epitelios humanos. El hongo comestible, conocido como champignon, Agaricus bisporus cultivado en la zona de Córdoba (Argentina) fue utilizado como material de partida. De un homogenato total del cuerpo fructificante del hongo se realizó la purificación de la lectina. Por cromatografía de afinidad, y utilizando una columna cromatográfica estromas de glóbulos rojos humanos entrampados en gel de poliacrilamida, se logra purificar ABL con alto grado de pureza. El producto obtenido muestra gran homogeneidad cuando se lo analiza por SDS-PAGE (Figura SDS-PAGE coomassie). Esta molécula se corresponde con un tetrámero de 64.000 Da de peso molecular (determinado por filtración molecular), constituido por cuatro sub-unidades idénticas de 16 kDa. Su estructura conformacional fue determina por difracción de rayos-X, para lo cual se ensayaron tres isoformas por separado. De las mismas solo la isoforma mas básica de ABL (pI 6,2), obtenida por isoelectroenfoque preparativo, pudo ser cristalizada (Figura 1 Acta Cristal). Utilizando el Hamptom Research Screens se encontró una condición de cristalización óptima en presencia de formato de sodio 4 M, Tris-HCL 0,02M, pH 8,0 y 30 mg/ml de ABL. El grupo espacial de la ABL correspondió a C222, obteniéndose una colección de datos estadísticos de resoluciones entre 1,5 y 2,2 A (tabla1 Acta Cristal). Por otra parte se consiguió la co-cristalización de ABL en presencia de ligandos glucídicos, obteniéndose cristales isomorfos. Cada monómero presenta dos regiones de plegamientos b, constituidas por un total del 10 regiones (A-J) de hebras plegadas en hojas b, y unidas por un motivo hélice-rulo-hélice. ABL posee cuatro sitios de unión al disacárido Galb3GalNAc y dos sitios que reconocen GlcNAc. El sitio de reconocimiento al disacárido corresponde a una depresión ubicada entre las hebras B®C, D®E y F®G en un costado y el motivo hélice-rulo-hélice en el otro. Como las interacciones más importantes, se destacan los aminos ácidos Ser48 y Asn73 mediante múltiples puentes hidrógenos. Interacciones simples muestran Gly49 y Ala29. Mediadas por moléculas de agua participan His72 y Arg107. Importante contacto hidrofóbico es observado con Tyr28, y en menor grado con Tyr74 y Tyr98. La serina del antígeno T (Galb3GalNAca-Ser) no participa en el reconocimiento. GalNAc interacciona con ABL a través del sitio que reconoce al disacárido, mientras que GlcNAc es reconocido por otro sitio de unión. Este sitio esta delimitado por la última hebra de la primera hoja b (hebra G) y la primer hebra de la segunda hoja b (hebra H), y la segunda de las dos hélices del motivo hélice-rulo-hélice. Las principales interacciones con GlcNAc son con Thr82 y Asp79, y con menor significancia con Arg103, Tyr114 y Ile80. Ambos sitios pueden diferenciar el hidroxilo epimérico del C4 de la N-acetilhexosamina. La demostración de que ambos sitios son activos fue llevada a cabo mediante ensayos de ELISA donde se utilizaron ligandos con terminales GlcNAc y Galb3GalNAc. Estos carbohidratos presentes en terminales glucídicos de glicolípidos o glicoproteínas fueron ensayados en la cuantificación de constantes de afinidad. Glicoproteínas como asialoglicoforina e IgA1, y glicolípidos como N6 (Galb3GalNAca4GalNAcb4GlcNAcb3Manb4Glcb-Cer) y N7 (GlcNAcb3Galb3GalNAca4GalNAcb4GlcNAcb3Manb4Glcb-Cer) mostraron constantes de afinidad de 166; 220; 221 y 205 x 10e6 (M-1) respectivamente. Las cuales revelaron una considerable mayor afinidad que con estructuras como IgA2 (con terminales Galb4GlcNAc de N-glicanos), A6 (GlcAb3Galb3GalNAca4GalNAcb4GlcNAcb3Manb4Glcb-Cer) y N5b (Galb3GalNAcb4GlcNAcb3Manb4Glcb-Cer) que mostraron constantes de 2,2; 73 y 69 10e6 (M-1) respectivamente, sin evidencia de interacción con GA1 (Galb3GalNAcb4Galb4Glcb-Cer). De donde se puede apreciar que estructuras terminales del tipo Galb3GalNAca como la presente en N6 cuando cambia su anómero a Galb3GalNAcb (como en N5b y GA1), su capacidad de interacción disminuye. También se observa el mismo fenómeno cuando al terminal de N6 se adiciona un ácido glucurónico (A6), lo que dificultaría su reconocimiento. Adicionalmente se decidió estudiar si esta interacción es inhibida por la presencia de carbohidratos involucrados en la interacción. Ensayos competitivos utilizando como ligandos IgA1 (conteniendo terminales Galb3GalNAca) mostraron que carbohidratos relacionados al disacárido como Galb3GalNAcapNP y Galb3GalNAc fueron 2000 veces mejores inhibidores de la interacción que GalNAc o pNPaGalNAc, dejando en evidencia el mayor reconocimiento por el disacárido que el monosacárido en la interacción con IgA1. También pudo apreciarse que Gal y sus derivados poseen inferior capacidad inhibitoria de dicha interacción que GalNAc, revelando una mayor significancia de GalNAc que Gal, en concordancia con la observación cristalográfica. Por otra parte, cuando estos ensayos de inhibición se realizaron utilizando ligandos con GlcNAc terminal, como los presentes en N-glicanos de ovalbúmina, se demostró que GlcNAc y sus derivados como el pNPaGlcNAc. Dando evidencias que el sitio de unión observado por cristalografía tiene actividad funcional. Es bien conocida la presencia de O-glicanos del tipo GlcNAc en núcleo celular. ABL mostró capacidad de interacción con glicoconjugados presentes en núcleos celulares tanto por fluorescencia como western blot. Ensayos de western blot utilizando matriz nuclear purificada y enfrentadas a ABL muestran multiples bandas de interacción, de las cuales algunas son inhibidas ante una previa incubación con GlcNAc. Lo que indicaría algún grado de reconocimiento a estas glicoproteínas nucleares muy relacionadas en la regulación de la transcripción celular. Esta propiedad podría estar relacionada con su efecto antiproliferativo en células de epitelio tumoral humano. Con el propósito de imitar la actividad antitumoral de ABL, se desarrollaron anticuerpos anti-idiotipos utilizando esta lectina como primer molde. Anticuerpos anti-ABL fueron generados en conejo y cuantificados por ELISA. Posteriormente se purificó IgG total de conejo anti-ABL utilizando proteina G-Sepharosa. Luego esta fracción IgG fue ofrecida a una columna de ABL-Sepharosa para purificar por afinidad la fracción de IgG de conejo anti-ABL. Esta fracción de IgG fue analizada en su capacidad de inhibir la interacción de ABL con asialoglicoforina, para la demostración de la existencia de anticuerpos contra el sitio de unión a carbohidratos de ABL. Posteriormente esta IgG anti-ABL fue inmunizada a ratones Balb/c hembras de 6-8 semanas de edad. Los anticuerpos anti-idiotipos de ratones fueron analizados contra diferentes antígenos tumorales, los que mostraron ser inhibidos cuando carbohidratos relacionados a TFD fueron estudiados. Estos antisueros también mostraron títulos aceptables cuando como blanco se ensayaron líneas de tumores epiteliales humanos como HT29, MCF7 y T47D. Estos anticuerpos mostraron alguna capacidad de inhibir la proliferación de dichas líneas tumorales, menor a la observada para ABL pero claramente mayor que los controles. Con la intensión de estudiar si ABL podría participar en el mecanismo de defensa del Agaricus bisporus, estamos analizando el efecto de esta lectina en el comportamiento de C. elegans. ABL purificada por cromatografía de afinidad (wild type) fue incubada con larvas en estadío 3 del gusano, previo al agregado de un medio de cultivo líquido que contenga E. coli como alimento. Luego se analizó su desarrollo y sobrevida en este medio, respecto a las muestras control. También, una nuestra recombinante de ABL fue expresada en E. coli utilizado un vector de expresión inducible por IPTG. A estas bacterias inducidas se le adicionaron larvas de C. elegans e igualmente se analizaron desarrollo y sobrevida del gusano. Ensayos preliminares muestran un efecto toxico por parte de ABL que nos permitiría suponer algún rol en la defensa del hongo hacia gusano terrestres.