Cambios temporales en metabolismo de glicerofosfolípidos y fosfatidilcolina en cultivos de fibroblastos sincronizados

ACOSTA RODRÍGUEZ VA; MARQUEZ S; SALVADOR GA; PASQUARÉ S; GORNÉ LD; GARBARINO PICO E; GIUSTO NM; GUIDO ME

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Jornada; V Jornadas de Bioquímica y Biología Molecular de Lípidos y Lipoproteínas; 2012

Introducción: Los relojes circadianos están presentes en todos los organismos estudiados y regulan una serie de eventos celulares y bioquímicos (Takahashi 2008). Resultados previos del laboratorio demostraron que un control circadiano en la biosíntesis de fosfolípidos en fibroblastos sincronizados (Marquez 2004). Objetivos: Estudiar cambios temporales en la biosíntesis y remodelado de glicerofosfolípidos (GFL) y de fosfatidilcolina (PC). Métodos: Cultivos de fibroblastos quiescentes fueron sincronizados con shock de suero de caballo 50% por 2 h y cosechados a distintas horas post-sincronización (pS). Se realizó la marcación metabólica de glicerofosfolípidos con 3H-glicerol y 32P-fosfato. Los niveles de ARNm se determinaron mediante RT-qPCR. Se examinó la expresión y localización subcelular de proteínas por Western Blot e inmunocitoquímica. Se midió la actividad enzimática in vitro con sustratos radiactivos. Resultados: La incorporación de 3H-glicerol en GFL en células sincronizadas presentó cambios en función del tiempo, con mínimos a las 28 y 56 h pS. Además, PAP1 (enzima que degrada PA y produce DAG) tiene menor actividad a las 35 y 56 h. Por otra parte, la marcación de PC con 3H-glicerol y 32P-fosfato mostró un perfil temporal similar al observado para GFL totales. Posteriormente, encontramos un patrón temporal diferencial en la expresión y actividad de enzimas de la vía de síntesis de PC (vía de Kennedy). Las oscilaciones temporales detectadas en Colina Kinasa (con mínimos entre las 28-35 h) acompañaban los cambios observados en la marcación de PC. En contraste, CTP:citidililtransferasa (CCT) presentó incrementos abruptos en su actividad a las 6 y 35 h pS, precediendo los aumentos en la marcación de PC. La expresión de la proteína y ARNm de CCTa incrementa a las 3 h pS, retornando luego a valores basales. En cambio, la isoforma CCTb permanece aumentada entre las 9-18 h pS. Ambas isozimas presentan mantienen su localización subcelular nuclear y citoplasmática, respectivamente. Por otro lado, se determinó que las aciltransferasas de lisofosfolípidos (LPC, LPS, LPE y LPI) presentan oscilaciones temporales en su actividad con mínimos alrededor de las 14 y 42 h alternados por máximos a las 28 h, indicando la existencia de una ventana temporal en el remodelado de lípidos de membrana. Conclusiones: Nuestros resultados demuestran la biosíntesis y el remodelado de GFL y PC están sujetos a una compleja regulación temporal en fibroblastos quiescentes y sincronizados.