Factores que impactan en la cuantificación de virus provenientes de muestras de agua

V.B. RAJAL; B.S. MCSWAIN; S. WUERTZ

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

La calidad microbiológica del agua se evalúa, según lo establece la legislación vigente, a través de la determinación de bacterias. No obstante, estos microorganismos no son indicadores de la presencia de virus, por lo que es fundamental su monitoreo específico. Aunque la cantidad de virus presentes en agua puede ser relativamente baja, en muchos casos es suficiente para producir enfermedad.La baja concentración de virus en aguas ambientales, insuficiente a veces para alcanzar los límites de detección de distintos métodos, hace necesario el uso de un proceso de concentración. Para ello, se construyó un sistema de ultrafiltración que consiste en dos unidades, de diferentes escalas, que operan en serie, permitiendo partir de 100 l de muestra para terminar con un concentrado de 70 ml. El sistema se validó y la eficiencia de recuperación de partículas virales se optimizó mediante el seguimiento de un control externo, el fago PP7 (de tamaño y propiedades similares al virus de polio) que se agregó a cada muestra procesada y se cuantificó en los distintos puntos del proceso mediante recuento en placa y PCR en tiempo real.El empleo de PP7 permitió también determinar las variables de mayor impacto en la cuantificación de patógenos y en particular de virus. Así, se observó la importancia de la composición de la matriz acuosa, especialmente en lo referido a la eficiencia de extracción de los ácidos nucleicos y a la inhibición de la reacción de amplificación de ADN, factores que afectan fuertemente en los límites de detección y cuantificación al emplear PCR en tiempo real.Las muestras de agua analizadas fueron inicialmente caracterizadas fisicoquímica y microbiológicamente, habiéndose determinado temperatura, pH, conductividad, turbidez, sólidos suspendidos, bacterias coliformes totales y fecales, Escherichia coli y Enterococos, según el caso, mostrando una gran variabilidad en los parámetros medidos. A todas ellas se les agregó una cantidad conocida de PP7 y fueron concentradas por ultrafiltración para la determinación cuantitativa de adenovirus y enterovirus empleando PCR en tiempo real. Las eficiencias de recuperación de partículas virales en el proceso de concentración fueron variables, en su mayoría mayor que el 50%, aunque mostrando extremos entre 10 y 98%. La eficiencia de extracción de ácidos nucleicos para todos los concentrados presentó una variación entre el 1 y el 10%, con promedio de 7%. La inhibición en la reacción de amplificación fue el efecto más importante y se superó gracias al desarrollo de un procedimiento de diluciones sucesivas que permitió cuantificar apropiadamente la contaminación. Todos los factores mencionados están contemplados en una ecuación desarrollada para calcular el límite de detección y de cuantificación para cada muestra, el que resulta altamente variable pero imprescindible de conocer a la hora de cuantificar virus en aguas y de estimar la magnitud del riesgo para la salud pública derivado de su uso.