Comparación de la eficiencia de detección de Trypanosoma cruzi en muestras de sangre murina por PCR convencional y PCR en tiempo real

C. DAVIES; H.R. POMA; R. CARDOZO; V.B. RAJAL; M.A. BASOMBRÍO

Mar del Plata

Congreso; IX Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias; 2011

Sociedad Argentina de Protozoología

Introducción: La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) combinada con métodos serológicos es una excelente prueba diagnóstica e indicadora de éxito terapéutico con agentes anti-T. cruzi en pacientes y modelos animales. Ambas técnicas amplifican fragmentos de específicos de ADN, pero sus métodos de detección son diferentes. En la técnica convencional, el ADN se detecta en un gel de agarosa iluminado con luz UV. En la PCR en tiempo real o cuantitativa (qPCR), la detección se realiza a partir de la fluorescencia acumulada de los amplicones, lo cual permite cuantificarlos al extrapolar sus valores a partir de una curva de calibración. Objetivo: Calcular sensibilidad, especificidad y concordancia entre qPCR y PCR convencional para detectar ADN de T. cruzi en sangre murina. Materiales y Métodos: Muestras: sangre de ratones infectados con T. cruzi y tratados con las drogas benznidazol, hidoximetilnitrofurazona, nitrofurazona o placebo. Se colocaron 700 uL de sangre en 1400 uL de buffer guanidina, y a las 24 hs se hirvieron por 10 min. Todas las muestras se analizaron por PCR convencional y qPCR. Reacción. PCR convencional: 3 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,1 uM primers 121 y 122, 1,65 unidades de GoTaq polimerasa y 10 uL ADN. Hot start. qPCR: 1X de SybrGreen, 1000 nM de primers Sat y 5 uL ADN. Amplificación: según las recomendaciones de SybrGreen (Invitrogen) seguida de un protocolo de disociación a 60 ºC. Curva de calibración de T. cruzi : sangre murina infectada artificialmente con una concentración final de 106 parásitos/mL, realizando diluciones seriadas 1/10 de ADN en un rango de 105 a 10-3 parásitos/mL. Resultados: De las 25 muestras analizadas por ambos métodos, 5 resultaron positivas y 20 negativas por qPCR, mientras que por PCR convencional sólo se detectaron 2 positivas y 23 negativas. El análisis estadístico reveló que la qPCR tuvo 100% de sensibilidad y 87% de especificidad tomando como referencia a la PCR convencional. A la inversa, la sensibilidad de la PCR convencional fue de 40% en este caso, con una especificidad de 100%. El valor de Kappa (0,52) demostró que la concordancia entre ambas técnicas es moderada. Discusión: La técnica de qPCR fue efectiva para detectar ADN de T. cruzi en sangre de ratones tratados con drogas tripanomicidas, aún en bajas cantidades, con una mayor sensibilidad y especificidad que PCR convencional. Las diferencias entre ambas técnicas pueden deberse, en parte, a que los métodos de extracción de ADN fueron diferentes, y a que en la extracción fenólica quedan inhibidores de la polimerasa que luego interfieren en la reacción.