Microbiología en tiempo real. Posibilidades y limitaciones

VERÓNICA B. RAJAL

Montevideo

Congreso; XX Congreso Latinoamericano de Microbiología; 2010

Los métodos basados en el cultivo, tradicionalmente empleados en microbiología, han evolucionado para permitirnos conseguir resultados más específicos y confiables. Sin embargo, al ser dependientes de la multiplicación de los microorganismos, involucran de manera inherente ciertos tiempos que resultan excesivamente largos para tomar decisiones o medidas correctivas en el campo de la salud pública y/o ambiental, o durante un proceso industrial. Por otro lado, no todos los microorganismos son cultivables. Los inconvenientes mencionados se han salvado gracias al acelerado desarrollo de los métodos basados en la secuencia genética. Específicamente, la Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real (qPCR) ofrece numerosas ventajas por sobre los métodos basados en el cultivo: mayor sensibilidad, especificidad, rapidez en la obtención de resultados y posibilidad de cuantificación. Además de la determinación de microorganismos, este método tiene numerosas otras aplicaciones como la detección de anomalías genéticas, la evaluación cuantitativa de la expresión genética, la identificación de genes responsables de determinados comportamientos, el rastreo del origen de la contaminación fecal de aguas, entre otros. Sin embargo, un inconveniente que el método presenta, siempre causa de discusión, es que si bien sirve para la detección del número total de patógenos presentes no brinda información sobre si están “vivos” o si son infectivos por lo que no se puede afirmar si son o no capaces de producir infección o enfermedad, llevando a una sobreestimación del riesgo sanitario, por lo que se adoptarían decisiones desde una postura de mayor protección. Cabe señalar que recientemente se han producido avances importantes en el intento por lograr la detección de patógenos “viables” o infectivos. Para el caso de bacterias se han reportado por un lado, métodos que se basan en la detección de m-RNA, por cuanto su corta vida permitiría determinar la presencia de bacterias en actividad o “viables” o que la contaminación ocurrió en un período de tiempo acotado. Por otro lado, se han desarrollado estrategias que combinan la aplicación de qPCR con el uso de colorantes capaces de ingresar a las células dañadas o “muertas” y unirse a su ADN, permitiendo así su diferenciación de las células “vivas” o viables. Según los resultados reportados estos métodos parecen ser eficaces para analizar la evolución de un proceso de desinfección mediante el uso de algún agente físico o químico; no obstante, no demostraron, por ahora, ser eficaces para la determinación de las cantidades de microorganismos “vivos” y “muertos” en muestras ambientales. Finalmente, es importante tener en cuenta la influencia de numerosas variables en la determinación mediante qPCR: tamaño de las muestras, la posible necesidad de incorporar procedimientos de concentración para alcanzar los límites de detección, procedimiento para la extracción de los ácidos nucleicos, la posible inhibición de la reacción por efecto de algún componente de la muestra y las eficiencias de las etapas involucradas.  Todas estas variables tienen importancia por cuanto impactan en los límites de detección de cada muestra, que deben ser indicados y analizados especialmente en el caso de resultados negativos.