EVALUACIÓN POR CITOMETRÍA DE FLUJO DE LA VIABILIDAD DE BACTERIAS LÁCTICAS VÍNICAS EXPUESTAS A UNA FRACCIÓN INHIBITORIA PEPTÍDICA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

LUCÍA M. MENDOZA; MARTA E. FARÍAS

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiología; 2010

Sociedad Argentina de Microbiología

La fermentación maloláctica (FML) en vinos es conducida por bacterias lácticas (BL), siendo Oenococcus oeni la principal especie involucrada. Esta fermentación secundaria es importante en la elaboración de vinos por disminuir la acidez, lograr la estabilidad microbiana y mejorar el sabor del producto fermentado. La FML generalmente ocurre al finalizar la fermentación alcohólica conducida por Saccharomyces cerevisiae. Aún cuando diversas cepas de O. oeni están adaptadas a crecer y sobrevivir en los vinos, la viabilidad de la bacteria depende de su capacidad para tolerar factores de estrés como acidez, etanol, SO2 y otros metabolitos producidos por las levaduras. En estudios previos determinamos que S. cerevisiae mc2 ejerce una marcada actividad antagónica sobre el crecimiento de O. oeni X2L y Lactobacillus hilgardii 5w, a través de un efecto sinérgico del etanol, SO2 y compuestos peptídicos de peso molecular 3-10 kDa. Objetivo: Evaluar mediante análisis por citometría de flujo el efecto de los compuestos peptídicos inhibitorios producidos por S. cerevisiae mc2 sobre la integridad celular de BL vínicas. La levadura se cultiva en medio jugo de uva durante 6 días a 25 ºC. El sobrenadante se utiliza como medio fermentado y como control se usa medio sin fermentar. Las BL se cultivan (106 ufc/ml) a 30 ºC en medios sin fermentar y fermentados hasta alcanzar la fase exponencial (24 h para O. oeni X2L y 12 h para L. hilgardii 5w). Asimismo, las BL se exponen a la fracción inhibitoria peptídica de S. cerevisiae, obtenida por fraccionamiento y concentración (membranas Amicon de 3 kDa) de los caldos fermentados por la levadura. El recuento de células vivas, dañadas y muertas se realiza por citometría de flujo empleando el kit de viabilidad BD mediante el cual se obtiene una tinción diferencial de acuerdo a la integridad de la membrana celular (sonda naranja de tiazol (TO): tinción de células totales y una solución de ioduro de propidio (PI): colorea las células muertas). El porcentaje de células dañadas y muertas de ambas BL es mayor en los medios fermentados en relación al control. Sin embargo, la intensidad de los fluorocromos varía de acuerdo a la especie de BL, presentando O. oeni mayor número de células teñidas con PI en relación con L. hilgardii. Cuando las células se exponen a la fracción inhibitoria peptídica, se observa un efecto más pronunciado (el número de células vivas disminuye 66,5 y 34,2% para O. oeni y L. hilgardii, respectivamente). La mayoría de las células de O. oeni se tiñen con PI, indicando un predominio de células muertas; mientras que el tamaño de la sub-población de células en un estado intermedio de daño de membrana (células con doble tinción TO-PI) es mayor para L. hilgardii, indicando que el compuesto inhibitorio peptídico ejerce una alteración progresiva del estado fisiológico de esta bacteria.