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RESUMEN Las propionibacterias son responsables de la apertura de la masa, del sabor y aroma de quesos tipo suizo y variedades similares. La fermentación propiónica ha sido explorada, además, para la manufactura de pan, vegetales fermentados y productos probióticos. Para identificar estas bacterias se han aplicado por años criterios bioquímicos, limitados a bacterias cultivables, y técnicas de biología molecular que requieren equipamiento costoso. La Hibridización Fluorescente In Situ (FISH) detecta secuencias de ácidos nucleicos utilizando sondas, marcadas con un compuesto fluorescente, que hibridizan a su secuencia blanco complementaria dentro de una célula intacta. Esta metodología, que permite identificar y cuantificar las bacterias en una comunidad compleja por microscopía de fluorescencia, no se ha descrito aún para propionibacterias lácteas. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue diseñar sondas específicas y establecer las condiciones óptimas de FISH para propionibacterias. Se diseñaron tres sondas: Pap, Pj y Pfr para P. acidipropionici, P. jensenii y P. freudenreichii, respectivamente. La técnica incluye: fijación, permeabilización, hibridización y lavado. En el primer paso se evaluó la fijación con y sin paraformaldehído. En el paso siguiente, se estudiaron distintas concentraciones de lisozima (0,1; 0,5; 1 y 5mg/ml), tiempos (5; 10 y 15 minutos) y temperaturas de incubación (4; 25 y 37ºC). En la etapa de hibridización, se probaron diversas temperaturas (37; 45; 50; 55; 60 y 70ºC). Las condiciones óptimas para la metodología utilizada son las que incluyen paraformaldehído, incubación con lisozima 1mg/ml durante 10 minutos a 25ºC y temperatura de hibridización de 45ºC para P. acidipropionici y P. freudenreichii, y 50ºC para P. jensenii.