Fusión de los genes estructurales de la bacteriocina Enterocina CRL35 y Colicina V

ACUÑA L.; SALVUCCI E.; SESMA F.; BELLOMIO, A.

Tucuman

Congreso; V Congreso Nacional de Estudiantes de Farmacia; 2006

Universidad NAcional de Tucuman

FUSIÓN DE LOS GENES ESTRUCTURALES DE LA BACTERIOCINA ENTEROCINA CRL35 Y LA MICROCINA COLICINA V Leonardo Acuña, Emiliano Salvucci, Fernando Sesma y Augusto Bellomio. CERELA (CONICET), INSIBIO (CONICET-UNT). acunaleonardo@hotmail.com Introducción: las bacteriocinas de clase IIa son péptidos antimicrobianos producidos por bacterias Gram (+). Las microcinas son péptidos de pequeño tamaño (menores a 10 kDa) secretados por enterobacterias Gram (-). Tienen espectro antimicrobiano reducido a bacterias filogenéticamente relacionadas a la cepa productora, bacterias Gram (+) o Gram (-) respectivamente. Objetivos: fusionar los genes estructurales de enterocina CRL35 y  de colicina V para obtener el gen quimérico ent-cvaC. Materiales y métodos: se levantaron por PCR los genes de enterocina CRL35 y colicina V, añadiendo en el cebador 5’ de enterocina (entFNco) un sitio de corte para Nco I y en el cebador 3’ (entR3G) la secuencia GGAGGAGGA codificante para 3 glicinas consecutivas a fin de servir como separador de los péptidos traducidos. En el cebador 5’ de colicina V (colF3G) se introdujo la misma secuencia GGAGGAGGA y en el cebador 3’ (colRBam) un sitio de corte para BamHI. Luego de amplificar los genes se los fusionó usando la técnica del megaprimer, mediante una reacción de PCR asimétrica. Como ADN molde se emplearon los amplicones obtenidos, como cebadores flanqueantes entFNco y colRBam y en las proporciones 1:10, 1:100 y 1:1000 con respecto a los cebadores mencionados el cebador interno entR3G o colF3G. El fragmento obtenido se clonó en el vector pCR 2.1-TOPO. El plásmido se digirió con las enzimas correspondientes y se clonó en el vector de expresión pET-28 con el que se transformó la cepa de Escherichia coli BL21[DE3] (pLysS). Resultados: en las reacciones de PCR asimétricas se obtuvo el gen quimérico ent-cvaC, la relación óptima entre los cebadores flanqueantes y el cebador interno fue 1:100. Se confirmó por digestión con enzimas de restricción y electroforesis de ADN y por PCR. Conclusiones: Se obtuvo un gen híbrido entre una bacteriocina y una microcina y su actividad antimicrobiana esta en proceso de evaluación.