Aplicación de sondas fluorescentes para el recuento de propionibacterias lácteas en cultivos mixtos y muestras ambientales mediante un protocolo de FISH

BABOT J.D.; APELLA M. C.; PEREZ CHAIA A.

Buenos Aires

Congreso; XII CONGRESO ARGENTINO DE MICROBIOLOGÍA- VI Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica – SADEBAC - I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental; 2010

Asociación Argentina de Microbiología

Antecedentes: Las propionibacterias clásicas cumplen un importante papel en la industria láctea. Algunas especies, principalmente Propionibacterium freudenreichii, se usan como cultivos iniciadores en la producción de quesos de tipo suizo como Gruyère y Emmental. En dichos quesos, son las principales responsables de la formación de los “ojos” por la liberación de CO2 y del flavor característico por la producción de ácidos grasos volátiles tales como ácido propiónico y ácido acético, productos de su fermentación. La enumeración de propionibacterias mediante métodos tradicionales es lenta y requiere incubación en anaerobiosis estricta, lo que dificulta el proceso. La Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) combina la precisión de la genética molecular con la información visual de la microscopía que permite la identificación y recuento de microorganismos en su micro hábitat natural. Objetivo: Determinar la eficiencia de sondas oligonucleotídicas marcadas fluorescentemente en la detección y enumeración de propionibacterias de una suspensión mixta con lactobacilos y muestras de queso Gruyère comercial. Materiales y métodos: Se mezclaron partes iguales de cultivos activos de P. acidipropionici CRL1198 y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CRL958 y se determinó  el número de UCF/mL mediante su recuento en medios de cultivo sólidos. La suspensión de células fue fijada con paraformaldehído. Posteriormente, se llevó a cabo la hibridización utilizando las sondas Pap446 y Lb158, específicas para P. acidipropionici y el género Lactobacillus, respectivamente. Para determinar si la matriz compleja de un queso interfiere en el recuento por la técnica de FISH, se realizó la determinación de propionibacterias en suspensiones de queso Gruyère filtradas, fijadas con paraformaldehido e hibridizadas con la sonda Pfr435. Paralelamente se estudió el número de estas bacterias en el mismo queso mediante el método tradicional de recuento en medios de cultivo sólidos, comparándose finalmente los resultados obtenidos por ambos métodos. Resultados: Los recuentos de P. acidipropionici y L. bulgaricus determinados mediante FISH mantuvieron la misma proporción que la obtenida por el método tradicional de recuento en medios sólidos. Por otro lado, las concentraciones de P. freudenreichii en queso obtenidas mediante FISH y por crecimiento en medio sólido (1,42 ± 0,1 × 109 bacteria/g y 1,02 ± 0,4 × 109 UFC/g, respectivamente) no presentaron diferencias significativas, encontrándose tales resultados en el mismo orden que los reportados previamente por otros autores. Conclusión: El método de FISH con las sondas usadas permite la enumeración precisa de propionibacterias en queso Gruyère, a pesar de constituir una matriz sumamente compleja, disminuyendo el tiempo para obtener resultados y evitando además la incubación en anaerobiosis estricta.