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El desarrollo de alimentos funcionales, en particular aquellos conteniendo microorganismos probióticos y/o compuestos prebióticos ha recibido particular atención de la industria alimentaria debido a la alta demanda de alimentos saludables por parte de los consumidores. Al respecto, la enzima β-galactosidasa reviste interés biotecnológico por cuanto confiere a los microorganismos que la poseen potencial probiótico para aliviar los síntomas de intolerancia a la lactosa o prebiótico como generadores de galactooligosacáridos (GOS) capaces de modular positivamente la microbiota intestinal. En este sentido, la selección de microorganismos para estos fines implica no solo la presencia excluyente de la enzima sino también la cuantificación de la actividad específica y el efecto de las condiciones ambientales en la misma. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad β-galactosidasa de un panel de bacterias lácticas grado alimentario (GRAS status) en cuanto a su capacidad de hidrólisis del sustrato en diferentes condiciones de pH y presencia de iones; como así también su actividad transglicosilasa sobre lactosa. Asimismo, se evaluó la capacidad de estos microorganismos de crecer a expensas de diferentes fuentes de carbono que involucran la actividad de la enzima β-galactosidasa. La actividad enzimática se determinó en extractos libres de células de los microorganismos mediante un método espectrofotométrico (DO420) usando el sustrato cromogénico ONPG análogo a la lactosa. El crecimiento fue evaluado por determinación a intervalos de la absorbancia a 560 nm de la biomasa bacteriana. Todas las cepas evaluadas mostraron actividad β-galactosidasa observándose cepas con baja, media y alta velocidad de hidrólisis. Los iones Na+ y K+ actuaron como estimulantes de la actividad enzimática mientras que Ca2+, Co2+, Ni2+, Fe3+, Mn2+ y Mg2+ mostraron efectos inhibitorios en diferentes medidas. Con respecto al pH todos los microorganismos evaluados mostraron actividad óptima a pH 6,5-7,0, menor actividad a pH 8 y actividad nula a pH 5. En cuanto a su capacidad de emplear la enzima β-galactosidasa para crecer empleando diferentes sustratos, el crecimiento más elevado se observó a expensas de GOS y lactosa, un desarrollo intermedio cuando los sustratos fueron lactulosa y oligosacáridos derivados de la misma y escaso crecimiento en permeado de suero y suero adicionado de extracto de levadura. L. bulgaricus CRL 450, la cepa con mayor actividad hidrolítica fue capaz de sintetizar GOS a partir de 30% de lactosa. Estos resultados representan el paso inicial en el estudio y la selección de microorganismos con potencial aplicación probiótica y/o prebiótica para ser aplicados en la producción de nuevos ingredientes funcionales relevantes para la industria alimentaria.