Diseño y validación de sondas para identificación de propionibacterias lácteas por hibridación fluorescente in situ (FISH)

BABOT J.D.; APELLA M.C.; PEREZ CHAIA A.

Archivos de Bioquímica, Química y Farmacia

Universidad Nacional de Tucumán

Lugar: San Miguel de Tucumán; Año: 2010 p. 82 - 83

0365 0871

Las propionibacterias son responsables de la apertura de la masa, del sabor y aroma de quesos tipo suizo y variedades similares. La fermentación propiónica ha sido explorada, además, para la manufactura de pan, vegetales fermentados y productos probióticos. Para identificar estas bacterias se han aplicado por años criterios bioquímicos, limitados a bacterias cultivables, y técnicas de biología molecular que requieren equipamiento costoso. La Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) detecta  secuencias de ácidos nucleicos utilizando sondas, marcadas con un compuesto fluorescente, que hibridan a su secuencia blanco complementaria dentro de una  célula intacta. Esta metodología, que permite identificar y cuantificar  las bacterias en una comunidad compleja por microscopía de fluorescencia, no se ha descrito aún para propionibacterias lácteas. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue diseñar sondas específicas, establecer las condiciones óptimas de FISH para propionibacterias y validar las sondas mediante técnicas de uso corriente. Se diseñaron tres sondas: Pap446, Pj446 y Pfr435 para Propionibacterium acidipropionici, P. jensenii y P. freudenreichii, respectivamente. La técnica incluyó: fijación, permeabilización, hibridación y lavado. En el primer paso se evaluó la fijación con y sin p#formaldehído. En el paso siguiente, se estudiaron distintas concentraciones de lisozima (0,1; 0,5; 1 y 5 mg/mL), tiempos (5, 10 y 15 min) y temperaturas de incubación (4, 25 y 37 ºC). En la etapa de hibridación, se probaron diversas temperaturas (37, 45, 50, 55, 60 y 70 ºC) y tiempos (1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 y 18 h). Las condiciones óptimas para la metodología utilizada son las que incluyen p#formaldehído, incubación con lisozima 1 mg/mL durante 10 min a 25 ºC y temperatura de hibridación de 45 ºC para P. acidipropionici y P. freudenreichii, y  50 ºC  para P. jensenii, durante 3 horas. Se determinó también que la hibridación es más específica en la etapa de crecimiento exponencial, e inespecífica durante la fase estacionaria. Para validar las sondas diseñadas, se identificaron mediante FISH dos cultivos, de un total de nueve aislamientos, como P. acidipropionici. La identidad de estas cepas se comprobó mediante PCR específica de  especie. El estudio de las cepas con API 50 CH no permitió su identificación certera, mientras que mediante el análisis de los productos de fermentación por HPLC, se comprobó la producción de ácido propiónico y acético por las dos cepas identificadas en relaciones molares coincidentes con las descritas en la literatura (Stackebrandt y col., 2006).