Transformación genética de una actinobacteria con importancia biotecnológica

ROSALES SORO, MARÍA DEL MILAGRO; POLTI, MARTA ALEJANDRA; PAPPALARDO, CRISTHIAN GABRIEL; PERNODET, JEAN-LUC; APARICIO, JUAN DANIEL

Jornada; XXI Jornadas Científicas y Encuentro de Jóvenes Investigadores Augusto E. Palavecino; 2020

Facultad de Bioquímica Química y Farmacia - Universidad Nacional de Tucumán

Introducción: Streptomyces sp MC1 produce numerosos metabolitos secundarios bioactivos con aplicaciones médicas, agrícolas e industriales. Además, presenta cualidades para su aplicación en procesos de biorremediación. Sin embargo, para mejorar estas cualidades y explotar su potencial es necesario comprender los sistemas genéticos implicados mediante técnicas moleculares innovadoras. Objetivo: Optimizar el sistema de conjugación entre E. coli S17-1 y Streptomyces sp. MC1Materiales y métodos: La transformación de células supercompetentes (RbCl) de E. coli S17-1 se realizó por shock térmico a 42 ºC. Se utilizó el plásmido pSC001, el cual cuenta con resistencia a apramicina (Apr) y contiene el gen mgfp para la expresión de la proteína fluorescente verde monomérica mGFP y el sistema de integración φC31 en actinobacterias. Para la conjugación se mezclaron células de E. coli S17-1/pSC001 (×0,1; ×1 y ×10) y esporos de Streptomyces sp. MC1 (107; 108 y 109). Luego de centrifugar se sembraron los pellets en placas con medio caseína almidón agar (CAA) + MgCl2 y se las incubó a 30 ºC. Después de 14 h se cubrieron con 3 mL de CAA (1/2) + ácido nalidíxico + Apr y se incubaron a 30 ºC durante 7 d. Finalmente se calculó la frecuencia de transferencia (Nº de exconjugantes/Nº de células receptoras). En seis exconjugantes se evaluó la incorporación del plásmido pSC001(mediante amplificación del gen mgfp), la expresión de la proteína mGFP (mediante microscopía de fluorescencia) y la integración comosómica del plásmido [mediante amplificación de cuatro regiones diferentes: attb (sitio de unión en la bacteria), attp (sitio de unión en el plásmido), attL (extremo izquierdo de inserción) y attR (extremo derecho de inserción)].Resultados: La frecuencia de conjugación intergenérica fue mayor (2,6*10-5) cuando se utilizaron las menores concentraciones celulares. En los seis exconjugantes se confirmó la incorporación del plásmido pSC001 al obtenerse amplicones del tamaño esperado (1200 pb) y la expresión de la proteína mGFP al visualizarse fluorescencia verde. El sitio attb solo se amplificó en la cepa original de Streptomyces sp. MC1, el sitio attp solo en el plásmido y los sitios attL y attR solo en los exconjugantes, corroborando la integración cromosómica del plásmido.Conclusión: Se logró una conjugación eficiente entre E. coli S17-1 y Streptomyces sp. MC1 en medio CAA, usando concentraciones celulares de ×0,1 y 107, respectivamente.