Purificación parcial de una enzima fibrinolítica producida por Bionectria sp. LY 4.1 en condiciones de cultivo sumergido optimizado

CARO FC; FARIÑA JI; PERALTA MP; DELGADO OD

Lima

Congreso; IX Congreso Latinoamericano de Micología; 2017

Asociación Latinoamericana de Micología

Las enzimasfibrinolíticas son proteasas que degradan fibrina, la proteína principal queforma los coágulos sanguíneos y cuya acumulación descontrolada conduce atrombosis y diversas enfermedades cardiovasculares, incluyendo infarto agudo demiocardio. Se han realizado diversos estudios en busca de nuevos agentestrombolíticos a partir de bacterias, algas, plantas, gusanos, veneno deserpiente, insectos y hongos. Estos últimos mostraron ser una opción prometedorapara la producción de enzimas fibrinolíticas, ya que las producen en cantidadessignificativas y principalmente de forma extracelular, lo que facilita suextracción/purificación. Estudios precedentes nos permitieron seleccionar a Bionectria sp. LY 4.1 como productor deenzimas con actividad fibrinolítica, y dicha capacidad pudo ser escalada abiorreactor con un medio de cultivo optimizado (MOPT) y bajo condiciones operativasseleccionadas para este fin. En este trabajo se avanzó en la purificación de laenzima mediante precipitación fraccionada a partir del extractocrudo enzimático (ECE) conteniendo actividad fibrinolítica, el que fue obtenidoa partir del caldo de cultivo de Bionectriasp. LY4.1 bajo condiciones optimizadas. Se utilizaron distintos volúmenes(2 y 4 volúmenes) de acetona en frío (-20°C) como agente precipitante. Elprecipitado recuperado (10000 × g / 30 min / 4°C) fue resuspendido en unpequeño volumen de buffer Tris-HCl 50 mM pH 7,8. Se corrieron dos geles nativosen paralelo (ND-PAGE), uno para determinar el perfil proteico de las muestras alo largo del proceso de purificación/concentración y otro, para realizar unzimograma que revele las bandas con actividad fibrinolítica. Adicionalmente, acada una de las fracciones se les determinó concentración de proteínas yactividad fibrinolítica para calcular actividad específica, factor depurificación y porcentaje de recuperación. Los resultados indicaron laconveniencia de precipitar las enzimas fibrinolíticas con 2 volúmenes deacetona, ya que esto condujo a un valor de actividad específica más elevado. Acordea esta metodología, la enzima fue purificada 35 veces con un porcentaje derecuperación del 89%. Aunque esto representaría una etapa preliminar, la queserá complementada con posteriores técnicas cromatográficas, los geles desnaturalizantes(SDS-PAGE) de la enzima parcialmente purificada revelaron una banda única de pesomolecular relativo de ~21 kDa.