Purificacion y parcial caracterización de una lipasa extracelular de A. niger MYA 135.

ROMERO CINTIA M.; PERA L; BAIGORÍ M

Tafi del Valle. Tucuman

Congreso; Jornadas Científicas Asociación de Biología de Tucumán. Tafi del Valle Tucumán; 2008

Asociaciòn de Biologìa de Tucumàn

  Introducción: Las lipasas son enzimas consideradas de interés económico por su capacidad de actuar como catalizadores en reacciones de hidrólisis y síntesis. Aspergillus niger, microorganismo GRAS, es utilizado para producir lipasas con propósitos biotecnológicos. En el presente trabajo utilizamos A. niger ATCC MYA 135 para producir una lipasa extracelular inducible obtenida a partir de cultivo sumergido. Objetivos. Purificar y caracterizar parcialmente una lipasa producida por A. niger MYA 135. Materiales y Métodos: El sobrenadante de cultivo se concentró usando PEG 20.000 y se recuperó en buffer fosfato 10 mM. Posteriormente se sembró y corrió la misma en un PAGE nativo. Una vez finalizada la corrida electroforética se cortó una de las calles sembradas y se reveló por actividad lipasa. La misma fue utilizada como patrón para cortar las bandas de las calles restantes. La purificación se realizó por electroelución, la banda seleccionada de mayor peso molecular que presentó actividad lipasa fue colocada en una membrana de diálisis con buffer Tris-Gly 25 mM. Después de la electroelución se concentró la muestra nuevamente con PEG 20.000. Para comprobar la purificación se midió actividad lipasa usando p-nitrofenil palmitato y se corrieron las muestras en un PAGE, que fue revelado con α-naftilacetato y α-naftilmiristato. Se determinó el punto isoeléctrico de la banda purificada, las condiciones óptimas de temperatura, pH y la constante de Michaelis-Menten (Km) frente a distintos sustratos: p-nitrofenil-acetato, propionato, palmitato y estearato (p-NPA, p-NPPr p-NPP y p-NPE). Se calculó su peso molecular aparente en geles PAGE-SDS y su estabilidad frente a solventes y detergentes iónicos y no iónicos. Resultados y Discusión: Se purificó una lipasa con un peso molecular de 104.7 kDa y un pI de 5.1. La misma presentó un Km (µM) de 0.13, 4.08, 0.017 y 0.60 frente a pNPA, pNPPr, pNPP y pNPE, respectivamente. La actividad enzimática mostró ser estable en el rango de temperaturas 4-55°C, en el rango de pH 2-10 y en presencia de los solventes ensayados. La lipasa fue estable en Tween 60, Tween 40 y saponina. No se observó actividad en presencia de los demás detergentes estudiados. La electroelución resultó ser una técnica rápida y práctica para la purificación de proteínas. La lipasa purificada fue parcialmente caracterizada, mostrando tener un importante potencial para su aplicación biotecnológica.