IBONE   05434
INSTITUTO DE BOTANICA DEL NORDESTE
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Transformación genética y producción de plantas transgénicas del Lotus tenuis portadoras del gen NHX1
Autor/es:
ESPASANDIN, FABIANA DANIELA; SANSBERRO, PEDRO A.; ALVAREZ, MAYRA Y; DIAZ PALEO, ANTONIO; AFFINITO, AGOSTINA
Lugar:
Chaco
Reunión:
Otro; XXV Reunión de Comunicaciones Científicas y Tecnológicas de la UNNE; 2019
Institución organizadora:
UNNE
Resumen:
El estrés salino es uno de los principales estreses abióticos que afectan seriamente el crecimiento y rendimiento de los cultivos. La salinidad afecta negativamente a las plantas por efectos osmóticos, toxicidad de iones específicos y/o desórdenes nutricionales. Las plantas tolerantes utilizan iones para el ajuste osmótico, ya que tienen la capacidad de secuestrar y acumular Na+ en las vacuolas, previniendo su acumulación en el citosol, favoreciendo una adecuada relación Na+/K+ en las células, mecanismo denominado compartimentalización en vacuolas. Dicho mecanismo se logra a través de anti-transportadores Na+/H+, especialmente del tipo NHX, localizados en el tonoplasto, acoplando el movimiento de Na+ hacia dentro de vacuolas (en contra del gradiente de concentración) con el de H+ hacia afuera, a favor del gradiente electroquímico generado por H+-ATPasas y H+-PPiasa. Con el objetivo de producir plantas transgénicas de Lotus tenuis portadoras del vector binario CaMV35s:LtNHX1:GFP y, seguidamente, detectar la inserción del gen de interés, se procedió a la transformación genética de Lotus tenuis con Agrobacterium tumefaciens conteniendo el vector de interés; que contiene la secuencia del anti-transportador NHX1 tomado de L. tenuis bajo el control del promotor constitutivo CaMV35s. Las técnicas de regeneración y transformación genética de las plantas de L. tenuis se llevaron a cabo mediante el uso de protocolos desarrollados previamente. Para la etapa de regeneración se emplearon medios de cultivo compuesto por las sales de Murashige y Skoog enriquecidos con reguladores de crecimiento vegetal (ácido naftalenacético y benciladenina). Para la etapa de transformación se utilizaron folíolos extraídos de plántulas de L. tenuis de 30 días de edad, los cuales fueron inoculados con la suspensión de A. tumefaciens transformada y co-cultivados a 28 ºC en el medio de regeneración, durante 3 días en oscuridad. Seguidamente, los explantes transformados fueron seleccionados adicionándose glufosinato de amonio y cefotaxima al medio de cultivo e incubados en luz (fotoperíodo 14 hs, 118 mol m-2 s-1 PAR) y 27±2 ºC. Los explantes fueron subcultivados quincenalmente a medios selectivos frescos a fin de mantener la presión de selección y evitar la proliferación bacteriana. Para verificar las plantas transgénicas se extrajo ADN genómico a partir de brotes de las plantas regeneradas y seleccionadas con el glufosinato de amonio. El material genético fue analizado mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos para el vector binario con los genes NHX R y 35s F. Los fragmentos amplificados del ADN genómico fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa (1%). Los experimentos se realizaron en diseños completamente aleatorizados. Se cultivaron 12 explantes por tratamiento, repitiéndose el experimento 3 veces. Como resultado se obtuvo un 44% de regeneración/selección luego de 90 días de cultivo transcurridos. Las plantas obtenidas fueron analizadas por PCR, confirmando la presencia del transgen en 5 plantas del total de explantes infectados con CaMV35S:NHX1:GFP, es decir que el 14% de los explantes regenerantes co-cultivados con las bacterias transformadas brindaron plantas transgénicas portadoras del mencionado gen. Éstos resultados se corresponden con una eficiencia de transformación de 18%. Como conclusión, se obtuvieron plantas transgénicas de Lotus tenuis que expresan CaMV35s:NHX1:GFP de manera constitutiva, basado en un sistema directo de regeneración de brotes, sin proliferación de callos. Las plantas no presentaron diferencias fenotípicas respecto a sus pares no transformadas bajo condiciones óptimas de crecimiento.