Crioconservación de explantes regenerados in vitro de Lotus tenuis mediante técnicas de vitrificación

BARONE, JAVIER; ESPASANDIN, FABIANA DANIELA; SANSBERRO, PEDRO A.; RUIZ, OSCAR A.

Bahia Blanca

Simposio; XI SIMPOSIO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA; 2017

REDBIO

La crioconservación es una técnica de conservación a largo plazo que, mediante la utilización de temperaturas ultra bajas provoca el cese de la división celular y de la mayoría de los procesos metabólicos y físicos. Comparada con otras técnicas, presenta ventajas muy favorables en cuanto a la optimización de costos y procesos. El desarrollo y perfeccionamiento de protocolos obedecen a necesidades e intereses particulares de las colecciones e instituciones que las albergan. Representa una de las opciones para la conservación de especies que presentan semillas recalcitrantes, que se propagan vegetativamente y aquellas que resultan de programas de hibridación somática e ingeniería genética. En este contexto, el programa de mejoramiento del género Lotus requiere de procedimientos que permitan la preservación a largo plazo de eventos transgénicos y genotipos mutantes de Lotus tenuis y L. japonicus, los cuales son propagados vegetativamenteA tal fin, brotes de 5 semanas de edad obtenidos por organogénesis directa y segmentos uninodales de Lotus tenuis y L. japonicus fueron sometidos a técnicas de encapsulación-deshidratación con inmersión directa en nitrógeno liquido, vitrificación con inmersión directa en nitrógeno líquido y una combinación de ambas (encapsulación-vitrificación) con inmersión directa en nitrógeno líquido y descenso térmico programado. Como sustancias crioprotectoras se utilizaron: como agentes penetrantes glicerol y dimetilsulfóxido (DMSO) y agentes no penetrantes: sacarosa y etilenglicol (EG) ensayándose distintas concentraciones (PVS 2, PVS 3, PVS 4 y algunas modificaciones de dichas soluciones). Para la encapsulación se realizaron cápsulas sintéticas de los diferentes tejidos mediante el uso de de alginato de calcio 3%.Al finalizar el experimento pudo observarse resultados favorables en la criopreservación de brotes adventicios de L. tenuis; demostrándose que, a partir del uso de la vitrificación (glicerol 30-50%) entre un 25±18% y 49±8% de los explantes sobreviven, brindando de 64 a 94 brotes adventicios. Altas concentraciones de EG y DMSO causan un efecto deletéreo, probablemente, atribuible a fitotoxicidad. El uso combinado de altos niveles de glicerol y sacarosa posibilitaron la conservación y recuperación de las yemas adventicias a través de un descenso térmico directo sin necesidad de aplicar un descenso paulatino programado. Contrariamente, ninguno de los tratamientos ensayados posibilitó la preservación de los segmentos uninodales de ambas especies siendo necesarios mayores estudios que permitan revertir su sensibilidad al estrés generado.