Análisis bioquímico y molecular en plantas regeneradas a partir de embriones somáticos crioconservados de Arachis Pintoi citotipo diploide

M FALOCI; RICARDO DANIEL MEDINA; H REY; LA MROGINSKI

Corrientes, Argentina

Congreso; 19na. Reunión de Comunicaciones Científicas y Técnicas de la Facultad de Ciencias Agrarias, UNNE.; 2008

Facultad de Ciencias Agrarias, UNNE.

El objetivo de este trabajo fue verificar la estabilidad genética de plantas de Arachis Pintoi, regeneradas a partir de embriones somáticos crioconservados y no crioconservados, empleando la técnica de RAPD y el análisis isoenzimático. Como material vegetal se utilizaron hojas de plantas regeneradas in vitro a partir de embriones somáticos de Arachis Pintoi, citotipo diploide, que fueron tratados para su conservación en nitrógeno líquido      (-196 ºC) siguiendo la técnica de la encapsulación - deshidratación y que provenían de dos tratamientos de crioconservación: 1) Inmersión directa en nitrógeno líquido y 2) Descenso controlado de temperatura hasta  –30 ºC, (1 ºC/min), seguida de inmersión en nitrógeno líquido. Se usaron como testigo las plantas regeneradas a partir de embriones somáticos no crioconservados. El ADN genómico fue extraído usando CTAB. Para la reacción de amplificación del ADN se emplearon 6 cebadores arbitrarios OPG02, OPG08, OPP02, OPP04, OPP07 y OPP08 (Operon Technologies). Los fragmentos amplificados fueron separados mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5%, teñidos con bromuro de etidio y visualizados con luz UV. Para evaluar la estabilidad genética entre plantas crioconservadas y testigo, los patrones de bandas RAPD se interpretaron utilizando análisis de agrupamiento, sobre la base de similitudes genéticas empleando el coeficiente de Dice. El análisis isoenzimático se llevó a cabo a empleando extractos del material vegetal en relación 0,1 g/mL con buffer de extracción, centrifugados a 14000 r.p.m. por 10 minutos. Se analizaron los siguientes sistemas isoenzimáticos: Fosfatasa ácida (ACP), Diaforasa (DIA), Esterasa (EST), Leucin aminopeptidasa (LAP), Peroxidasa (PER) y Deshidrogenasa siquímica (SAD), en geles discontinuos de poliacrilamida no desnaturalizante 7,5 %-3 % (PAGE). La electroforesis se llevó a cabo a 4°C y a intensidad constante de 1,2 mA/cm. El revelado de los geles se efectuó empleando una mezcla de reacción específica para cada sistema enzimático. Los cebadores utilizados permitieron amplificar 50 fragmentos en el rango de 400 – 3000 bp, siendo 3 de ellos polimórficos y los restantes monomórficos. Del análisis de agrupamiento surge que tanto las plantas crioconservadas como las plantas testigo se distribuyen al azar, en un rango de similitud que va de 1 a 0,91. Los sistemas ACP, EST, DIA y SAD, se presentaron como monomórficos mientras que LAP y PER resultaron polimórficos. De los sistemas isoenzimáticos estudiados, el 33,3 % presentaron polimorfismos, siendo LAP el sistema más polimórfico. Estos polimorfismos pudieron asociarse a pequeñas variaciones encontradas en las plantas testigo las cuales pueden ser visualizadas, en las plantas provenientes de los dos tratamientos de crioconservación. Del análisis RAPD y la evaluación isoenzimática se concluye que no hay diferencias que puedan ser atribuidas a la técnica de crioconservación y que tampoco existen diferencias entre los tratamientos de crioconservación aplicados. Esto haría posible la conservación de germoplasma de Arachis Pintoi citotipo diploide a -196 °C, por cualquiera de los métodos empleados sin la aparición de cambios genéticos que puedan ser detectables mediante estas técnicas.