DESARROLLO DE CEBADORES DE TUBULINA β, ESPECÍFICOS DE Ilex Paraguariensis, PARA ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GENÉTICA

ACEVEDO, RAÚL M.; RUIZ, OSCAR A.; SANSBERRO, PEDRO A.

Corrientes

Encuentro; XXIIº REUNION DE COMUNICACIONES CIENTIFICAS, TECNICAS Y DE EXTENSIÓN; 2011

Facultad de Ciencias Agrarias - Univ. Nac. del Nordeste

Para poder detectar pequeñas variaciones, los análisis de expresión genética requieren alta sensibilidad, precisión y especificidad para la secuencia del ARNm en estudio. La Transcripción Reversa seguida de PCR en Tiempo Real (RT-PCR) se ha convertido en el método de elección por cumplir estos requisitos. En los ensayos, las variaciones de expresión entre diferentes muestras, se analizan mediante cuantificación relativa del gen de interés. Para ello, estos valores se deben normalizar con respecto a un gen de referencia definido como control interno, debido a que su nivel de expresión no se ve afectado por el experimento ni por las condiciones fisiológicas; y no presenta variabilidad entre distintos individuos. En plantas, el gen de la Tubulina ß presenta una gran estabilidad y por ello es ampliamente utilizado como gen de referencia. En la yerba mate actualmente no se dispone de secuencias relacionadas a este gen. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue diseñar cebadores del gen de Tubulina ß, específicos para Ilex paraguariensis. Para lograrlo, se utilizaron cebadores diseñados sobre regiones conservadas encontradas sobre un alineamiento de 26 secuencias de Tubulina ß disponibles en GenBank® (National Center for Biotechnology Information) de diferentes especies vegetales, con la menor distancia filogenética posible a nuestra especie. Estos cebadores fueron inespecíficos ya que presentaron dos bandas de distintos tamaño en la electroforesis en gel de agarosa. Ambos productos fueron clonados en Escherichia coli DH5α, y secuenciados en MacroGen® (Corea del Sur), encontrando similitud significativa con Tubulina ß en uno de ellos. En la región interna de esta secuencia se diseño un par de cebadores, que presentaron un único producto de amplificación, que fue clonado y secuenciado, repitiéndose la misma secuencia interna sobre la que fue diseñado. Lo que permite afirmar que se trata de cebadores de Tubulina ß, específicos para Ilex paraguariensis. La obtención de estas secuencias específicas, son el primer paso necesario para avanzar en los análisis de los niveles de expresión genética. Siendo necesario a continuación, validarlos como gen de expresión constitutiva.Ilex paraguariensis. Para lograrlo, se utilizaron cebadores diseñados sobre regiones conservadas encontradas sobre un alineamiento de 26 secuencias de Tubulina ß disponibles en GenBank® (National Center for Biotechnology Information) de diferentes especies vegetales, con la menor distancia filogenética posible a nuestra especie. Estos cebadores fueron inespecíficos ya que presentaron dos bandas de distintos tamaño en la electroforesis en gel de agarosa. Ambos productos fueron clonados en Escherichia coli DH5α, y secuenciados en MacroGen® (Corea del Sur), encontrando similitud significativa con Tubulina ß en uno de ellos. En la región interna de esta secuencia se diseño un par de cebadores, que presentaron un único producto de amplificación, que fue clonado y secuenciado, repitiéndose la misma secuencia interna sobre la que fue diseñado. Lo que permite afirmar que se trata de cebadores de Tubulina ß, específicos para Ilex paraguariensis. La obtención de estas secuencias específicas, son el primer paso necesario para avanzar en los análisis de los niveles de expresión genética. Siendo necesario a continuación, validarlos como gen de expresión constitutiva.