Evidencias bioquímicas, moleculares y biocomputacionales del efecto de compuestos naturales sobre un novedoso blanco terapéutico para aterosclerosis

CASTRO M.A.; GARCIA DE BRAVO M.; GAVERNET LUCIANA; LLANOS MANUEL AUGUSTO; CRESPO R.

La Plata

Jornada; Jornadas de Investigación 2018; 2018

Fac de Ciencias Médicas UNLP

Introducción: La aterosclerosis es una enfermedad cardiovascular (ECV) caracterizada por un engrosamiento de las paredes arteriales debido al depósito de lípidos principalmente el colesterol (Col) y a una respuesta inflamatoria crónica promovida por macrófagos y células espumosas. Las ECVs son la principal causa de muerte y discapacidad a nivel mundial siendo la hipercolesterolemia el factor que contribuye al 56% de los casos de cardiopatía coronaria. Los niveles de Col plasmático se regulan por mecanismos como la síntesis de novo del Col o vía del mevalonato (VM) principalmente activa en hepatocitos. En las primeras etapas de la VM (reacciones pre-escualeno) se generan isoprenoides no esteroideos como ubiquinona, dolicol y grupos prenilos involucrados en la transcripción de ARN, síntesis de ATP y prenilación y glicosilación de proteínas. La enzima óxido escualeno ciclasa (OSC) es quien cataliza la reacción de ciclación del escualeno para formar lanosterol que es el primer componente cíclico de la VM del cual derivan todos los esteroides. La inhibición de la OSC representa un blanco terapéutico muy prometedor como agente hipocolesterolemiante debido a que interviene en una reacción post-escualeno lo que implicaría inhibir la síntesis de Col sin afectar la de moléculas no esteroideas. Asimismo, su inhibición parcial produce oxiesteroles endógenos, que son fuertes ligandos del receptor nuclear LXR involucrado en la regulación de la expresión de enzimas de la vía de síntesis de triglicéridos (GPAT) y de proteínas ABC responsables del transporte reverso del Col. Actualmente, los fármacos hipocolesterolemiantes más utilizados son las estatinas, cuyo diana es la HMG-CoA reductasa, enzima que actúa en las primeras etapas de la VM (pre-escualeno) pero que resultan poco efectivas en disminuir los niveles de triglicéridos plasmáticos y pueden producir miopatías. El aceite de cáscara de mandarina (ACM) posee compuestos naturales (GRAS), mayoritariamente limoneno (Li), con potencial actividad hipocolesterolemiante y antiaterogénica. Objetivo general: Evaluar el efecto del ACM sobre el metabolismo lipídico en hepatocitos y macrófagos, células que cumplen un rol fundamental en la regulación de la homeostasis del colesterol y del proceso inflamatorio en lesiones vasculares, para encontrar nuevos blancos terapéuticos antiaterogénicos de baja toxicidad.Materiales y métodos: Se utilizaron concentraciones de 0-60 µL/L de ACM y Li en una línea celular proveniente de un hepatoblastoma humano (HepG2) y una línea tumoral de macrófagos murinos (Raw 264.7). Las HepG2 fueron incubadas las últimas 3 hs de tratamiento con 14C-acetato. Los lípidos fueron extraídos por el método de Folch, separados e identificados por TLC, cuantificados en contador de radiactividad y analizados en equipo Storm. Las Raw 264.7 se diferenciaron de macrófagos a células espumosas incubando 8 hs con LDLox (50 μg/mL). El contenido lipídico teñido con Oil-Red-Oil se analizó por microscopía y espectrofotometría. La expresión de la enzima GPAT3 y del receptor CD36 se cuantificó por RT-qPCR. Los componentes del ACM fueron sometidos a simulaciones de docking molecular para proponer un modo de interacción con la OSC utilizando una estructura cristalográfica obtenida del Protein Data Bank. La metodología se validó con el estudio de inhibidores reportados. Se realizaron simulaciones de dinámica molecular de los candidatos en el sitio de unión.Resultados: Se observó que concentraciones menores a 60 µL/L del ACM y Li en las células hepáticas inhiben la síntesis de Col pero incrementan los niveles de incorporación de 14C-acetato en productos de reacciones pre-escualeno como la ubiquinona y escualeno. En células espumosas disminuyen los depósitos de lípidos intracelulares y la expresión de receptores CD36 pero aumentan los niveles de GPAT3. Mayores concentraciones del ACM mostraron una disminución en la incorporación del 14C-acetato en Col y en todos los intermediarios de la VM detectados, así como en distintos glicerolípidos neutros y polares. Los depósitos de lípidos en las células espumosas disminuyeron significativamente sólo en las células tratadas con el ACM. Las simulaciones computacionales muestran que el Li es capaz de interaccionar con la enzima OSC en una región cercana al sitio catalítico y que el alfa-farneseno y el neril-acetato (componentes minoritarios del ACM) también son capaces de interaccionar eficientemente con la OSC.Conclusiones: El ACM disminuye la síntesis de colesterol y los depósitos de lípidos intracelulares sugiriendo una inhibición de la enzima OSC principalmente por el Li, lo que se complementa con las simulaciones computacionales que sugieren la existencia de un nuevo sitio de modulación alostérica de la enzima por el mismo. Estos resultados constituyen evidencias muy alentadoras para avanzar con la validación del ACM como inhibidor de la OSC, potencial blanco terapéutico para la prevención y/o tratamiento de la aterosclerosis.