Proteómica diferencial de macrófagos humanos tratados con apolipoproteína A-I: Posible rol de Nrf2 en la respuesta antioxidante

GARDA, H.; SEBASTIÁN ALEJANDRO TREJO; IVO DÍAZ LUDOVICO; GONZALEZ, M

La Plata

Congreso; Jornadas de Medicina 2018; 2018

Introducción: La aterosclerosis (acumulación lipídica en paredes arteriales) junto con otras enfermedades cardiovasculares, es una de las principales causas de muerte en países industrializados. La apolipoproteína humana A-I (apoA-I) es el componente proteico mayoritario de las lipoproteínas de alta densidad (HDL). La HDL es la principal lipoproteína encargada del transporte reverso del colesterol (TRC), proceso por el cual el exceso de colesterol es transportado desde los tejidos periféricos hacia el hígado para ser excretado como sales biliares y está involucrado en la fisiología natural de la prevención del desarrollo aterosclerótico. Estudios sobre los sistemas de transducción de señales activados o inhibidos por la interacción celular con apoA-I intentan dilucidar los mecanismos moleculares que aún son desconocidos y que estén involucrados en las primeras etapas TRC. Conocer los procesos celulares involucrados en el TRC facilita una perspectiva con implicancia clínica para la prevención y tratamiento del desarrollo de aterosclerosis.Objetivos: Determinar los niveles de expresión de distintas proteínas involucradas en la respuesta celular de macrófagos humanos estimulados con apoA-I a concentraciones fisiológicas. Materiales y métodos: La ApoA-I recombinante se obtuvo mediante expresión en E. coli y posterior purificación por cromatografía de afinidad. Para los ensayos celulares se utilizaron monocitos humanos THP-1, los cuáles fueron mantenidos en medio RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal bovino hasta confluencia. Los monocitos fueron diferenciados a macrófagos por estimulo con ésteres de forbol (PMA-1ng/ml). Triplicados biológicos fueron incubados con RPMI sin suero (tratamiento control) y RPMI sin suero suplementado con 30µg/ml apoA-I durante 12h. La extracción de proteínas totales se realizó con buffer RIPA separando las proteínas solubilizadas de otros restos celulares por centrifugación a 12.000 r.p.m. a 4°C. Los extractos proteicos totales fueron tratados con DTT (10mM) e Iodoacetamida (20mM) y luego las proteínas fueron precipitadas por agregado de TCA (20% m/v). El pellet proteico fue lavado con acetona para remover restos lipídicos y llevado a sequedad bajo aire estéril. Las muestras fueron tripsinizadas, separadas por columna de fase reversa (C18) y analizadas en el espectrómetro cuadrupolo con tecnología orbitrap: Q-Exative?. Los espectros obtenidos fueron analizados con dos softwares distintos para robustecer la fidelidad de los resultados: Proteome Discoverer y MaxQuant. Las cantidades relativas de las proteínas identificadas fueron analizadas estadísticamente por t-Student mediante el software Perseus. La validación de los resultados obtenidos fue realizada por western blot con anticuerpos policlonales generados en ratón (Santa Cruz Biotechnology). La adquisición de imágenes se realizó por ImageQuant y las cuantificaciones relativas de las bandas fueron realizadas mediante el software ImageJ.Resultados: Los espectros MS/MS permitieron identificar alrededor de 2000 proteínas en cada triplicado biológico. Se detectaron un total de 7 proteínas con niveles diferenciales de expresión en las células tratadas con apoA-I. El análisis por western blot de las proteínas: proteína 1 con dominio EH (EHD1); molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1); hemo oxigenasa 1 (HO-1); metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9); homólogo de la proteína regulatoria de biogénesis ribosomal (RRS1) y Sequestosoma-1 (p62), validó los niveles de expresión diferenciales de las mismas obtenidos por espectrometría de masas.Conclusiones: El tratamiento de macrófagos THP-1 con apoA-I incrementa los niveles celulares de las proteínas ICAM-1, HO-1, p62, MMP9, EHD y RRS1. La sobreexpresión de HO-1 y p62, cuyos genes son regulados por el factor nuclear eritroide 2 (Nrf2) en respuesta al desequilibrio redox en la célula, nos permite plantear como hipótesis que apoA-I podría activar la vía mediada por dicho factor. Al momento se están realizando estudios adicionales para profundizar sobre el mecanismo de activación de Nrf2 mediado por apoA-I.