CARACTERIZACIÓN DEL PERFIL INFLAMATORIO DEL HIPOCAMPO DE LA RATA SENIL CON DÉFICIT COGNITIVO: LA MICROGLÍA QUE SOBREEXPRESA TYROBP COMO MODELO DE ESTUDIO

PARDO J; ARIZA S; MOREL GR; REGGIANI PC

La Plata

Congreso; Jornadas de Investigación 2018. Facultad de Ciencias Médicas UNLP; 2018

Facultad de Ciencias Médicas de la UNLP

INTRODUCCIÓN: La edad es el componente etiológico más importante en el desarrollo de las enfermedades neurodegenerativas. En nuestro laboratorio hemos caracterizado a la rata Sprague Dawley (SD) hembra senil 29-32 meses como modelo de envejecimiento cerebral y déficit cognitivo. La Enfermedad de Alzheimer (EA), cuyo principal factor de riesgo es el envejecimiento, está marcada por eventos neuroinflamatorios que involucran a la glía, incluidos los astrocitos y, en particular, la microglía. Nuestro objetivo general es dilucidar los mecanismos celulares y moleculares de la neurodegeneración tanto en el envejecimiento normal como en la EA.OBJETIVOS: 1- Caracterizar el envejecimiento cerebral desde el punto de vista del déficit cognitivo y la neuroinflamación del hipocampo.2- Estudiar el transcriptoma diferencial asociado al envejecimiento del hipocampo, una región cerebral clave en la formación y retención de la memoria, e identificar genes proinflamatorios sobreexpresados en la microglia senil.3- Establecer un modelo celular de neuroinflamación en células microgliales.MATERIALES Y MÉTODOS: Obj.1: Se utilizaron ratas viejas de 28 meses de edad versus jóvenes de 4 meses. Para estudiar el déficit cognitivo en el envejecimiento se evaluó la memoria espacial en el Laberinto Barnes (LB). Para estudiar la neuroinflamación en el hipocampo se realizó un estudio microscópico de la población microglial, mediante inmunohistoquímica contra Iba1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1). Obj.2: Para estudiar la transcriptómica diferencial se realizó el secuenciamiento de ARN de hipocampo derecho de ratas jóvenes y viejas. Obj. 3: Para obtener el modelo celular de neuroinflamación construimos dos lentivirus (LV): un bicistrónico que sobreexpresa simultaneamente Tyrobp y la proteina fluorescente verde (GFP) y, otro, que sobreexpresa la proteina quimera Tyrobp-GFP; como control se construyó un LV que codifica sólo para GFP. Las células de microglía de ratón BV2 fueron utilizadas como modelo celular para evaluar el impacto de la sobreexpresión de Tyrobp.RESULTADOS: Obj.1: Ambos grupos de ratas mostraron en el LB un adecuado aprendizaje así como un claro pico de exploración en el agujero meta, siendo la amplitud de este pico y la velocidad del aprendizaje significativamente superior en los animales jóvenes. A nivel morfométrico, la declinación cognitiva en la rata vieja viene aparejada de un aumento en la activación microglial en la zona del Stratum radiatum del hipocampo. Obj.2: El secuenciamiento de ARN demostró que 5 genes involucrados en la neuroinflamación están sobreexpresados: C3, CD11b, CD4, CD74 y TYROBP, en el hipocampo de la rata vieja. Una vez identificados estos genes proinflamatorios, nos enfocamos en el gen TYROBP, dado que la proteína Tyrobp, entre otras funciones, es un adaptador de superficie celular, media la fagocitocis y la supresión de la respuesta inflamatoria. Dicha proteína se expresa exclusivamente en células microgliales. Obj.3: Basándonos en los resultados de secuenciamiento de ARN, nos propusimos evaluar el rol de Tyrobp en la activación microglial y la neuroinflamación en las células BV2. Comprobamos la correcta contrucción de los lentivirus: el que sobreexpresa Tyrobp y GFP por separado (LV-pEF1-Tyrobp-T2A-GFP), el que sobreexpresa la proteina quimera Tyrobp fluorescente verde (LV-pEF1-Tyrobp-GFP) y los respectivos controles, que expresan solamente GFP (LV-pEF1-Tyrobp-T2A-GFP y LV-pEF1-Tyrobp-GFP). Las BV2 se transdujeron con estos LV y, 3 días después, observamos fluorescencia verde distribuida en la totalidad de la célula para los casos en que la GFP se expresa de manera independiente; sin embargo, e interesantemente, observamos que la proteina quimera Tyrobp-GFP tiene una distribución celular característica coincidente con la observada en preparados de inmunohistoquímica contra Tyrobp en la microglia de cerebro de roedores y humanos. Debido a que los LV se integran al genoma celular, las BV2 transducidas mantienen la expresión transgénica por lo tanto se establecen dos nuevas líneas celulares microgliales que sobreexpresan constitutivamente Tyrobp.CONCLUSIONES: El envejecimiento en la rata SD está marcado por una pérdida de capacidad de aprendizaje y memoria espacial, que correlaciona a nivel hipocampal con un aumento de la reactividad microglial. Esto se corresponde con un aumento de genes proinflamatorios, entre ellos el gen de la proteína Tyrobp. Futuros estudios en las líneas celulares BV2 generadas en este trabajo permitirán dilucidar el impacto de Tyrobp en las células microgliales asociado al envejecimiento cerebral y a las enfermedades neurodegenerativas.