Efecto de la metil-beta-ciclodextrina en bicapas de DOPC/16:0 SM/Cho medido in situ por AFM

MATÉ, SABINA; VAZQUEZ, ROMINA F.; DAZA MILLONE, MARÍA A.; VELA, MARÍA E.

Congreso; Congreso Sociedad Argentina de Microscopía; 2018

Efecto de la metil-β-ciclodextrina en bicapas de DOPC/16:0 SM/Cho medido in situ por AFMM. Antonieta Daza Millone,a Romina Vazquez,b Sabina Maté,b y María Elena VelaaaINIFTA-CONICET-UNLP, La Plata, ArgentinabINIBIOLP-CONICET-UNLP, La Plata, Argentina1. IntroducciónLas ciclodextrinas (CDs) son una familia de oligómeros cíclicos de glucosa que contienen un interior capaz de solubilizar moléculas hidrofóbicas. Por este motivo, se han empleado como portadores de drogas liposolubles y en estudios biofisicoquímicos de membranas. En particular, el mecanismo de extracción de colesterol (Cho) por las CDs no está del todo comprendido.[1] Existen distintas hipótesis que contemplan mecanismos de difusión, unión o inserción y distintas prioridades de extracción según el grado de empaquetamiento lipídico. La mayor parte de las técnicas empleadas requieren algún tipo de marcado (fluorescente, radiactivo), a excepción de calorimetría,[2] resonancia de plasmones superficiales (SPR)[1] y la microscopía de fuerzas atómicas (AFM). [3] Esta técnica puede brindar además información in situ de los cambios morfológicos y nanomecánicos del sistema.2. ObjetivoEstudiar los cambios inducidos por la inyección in situ de metil-β-ciclodextrina (MβCD) en un sistema modelo de membrana externa de glóbulos rojos consitituido por DOPC/16:0 SM/ Cho (2:1:1).3. Procedimiento experimentalSe prepararon bicapas soportadas sobre mica por fusión de vesículas de DOPC/16:0 SM/ Cho (2:1:1) como se describe en Maté et al.[4] Las muestras se colocaron en la celda de líquidos de un microscopio Nanoscope V (Veeco, USA) y se tomaron imágenes en modo contacto en buffer HEPES pH 7.4 (Figura 1) y mapas de fuerza (FV). Durante la medición, si detener el barrido, se inyectó en la celda 40 μL (volumen de celda) MBCD 1 mM y se continuó con la adquisición de imágenes. Después de 30 min de la inyección se tomaron mapas FV. A continuación se inyectó MBCD 3 mM, también registrando imágenes y mapas FV.4. ResultadosLas bicapas de DOPC/16:0 SM/ Cho a 23 °C presentan segregación de dominios, Ld (líquido desordenado) y Lo (líquido ordenado). Cada dominio presenta una fuerza de ruptura (Fb) característica de 4,79 ± 0.01 nN (Ld) y 12,32 ± 0.03 nN (Lo). Al inyectar MβCD 1 mM, los dominios Lo cambian su morfología y hay una redistribución de las Fb, en especial la componente asociada a Lo disminuye se ensancha. Finalmente, con MβCD 3 mM desaparecen los dominios Lo y la distribución de Fb muestra un único máximo a 4,5 ± 0.2 nN.5. ConclusionesA diferencia de reportes previos,[5] se observó que la MβCD a concentraciones bajas (1 mM) extrae Cho tanto de los dominios Ld como Lo del modelo DOPC/16:0 SM/Cho. En los dominios Lo, se observan cambios morfológicos y nanomecánicos. A concentraciones mayores (3 mM) se logra una mayor extracción de colesterol de manera que la bicapa pierde su integridad y la resultante presenta una única fase. Mediante este sencillo modelo, se podrían correlacionar los cambios observados en membranas de glóbulos rojos y sus consecuencias en la función celular.[1] Beseničar, M. et al. BBA-biomembranes, 1778 (2008), 175-184[2] Tsamaloukas, A. et al. Biophys. J., 89 (2005), 1109-1119[3] Giocondi, M. C. et al. Biophys J. 86 (2004), 861?869[4] Maté, S. et al. BBA 1838 (2014), 1832-1841[5] Sanchez et al., J. Membr. Biol. 241 (2011), 1?10