Efectos de sobrecargas de cobre en el metabolismo del colesterol

ZUBILLAGA MARLENE; ASTIZ MARIANA; ROSA DIANA; ARNAL, NATHALIE; TRICERRI ALEJANDRA

Jornada; Jornadas de Medicina; 2018

Fac Cs Médicas

Introducción: El cobre (Cu) ha sido involucrado en el desarrollo de muchos desórdenes neurodegenerativos como el mal de Alzheimer, Parkinson, demencias, entre otros. Por otro lado, el colesterol (Cho) es un componente estructural fundamental para la fluidez de las membranas plasmáticas como así también como precursor de hormonas esteroideas y sales biliares. El cerebro contiene un cuarto de Cho corporal total, aunque no tiene acceso al suministrado por síntesis hepática o absorción intestinal (dieta). Por lo tanto, las células cerebrales dependen completamente de la síntesis in situ de Cho por la vía del mevalonato.Varias publicaciones han demostrado que se producen aumentos de los niveles de Cho plasmáticos en animales que expuestos a sobrecarga de Cu (Armstrong et al., 2001; Sauer et al., 2011; Arnal et al., 2013). Más aún, hay trabajos publicados que demuestran aumentos de la transcripción de genes relacionados con la síntesis de Cho en células en cultivo expuestas a Cu (Svensson et al., 2003; Gutierrez-Gracía et al., 2013). La proteína precursora amiloide (APP) esta alojada en raft de Cho. Se ha demostrado que aumentos de los niveles de Cho favorecerían el procesamiento de APP hacia la formación de péptidos Aβ generadores de las placas presentes en los pacientes con AD (Liu et al, 2009)Objetivos: El objetivo de este trabajo es corroborar la hipótesis que plantea que aumentos en los niveles de Cu podrían aumentar la síntesis de Cho. Materiales y métodos: se utilizó una línea celular establecida derivada de neuroblastoma (SH-SY5Y). Se cultivó en botellas de 75 cm2 (Falcon®) con medio DMEM/F12 (1:1) conteniendo L-Glutamina en atmósfera húmeda con 5 % de CO2 y 37 °C.Análisis de IC50: se ensayaron diferentes concentraciones crecientes de CuSO4 (entre 0-1,5 mM) en placa de 96 wells utilizando 40.000 células/well durante 24 hs. Luego del tratamiento se midió viabilidad por la técnica de Reazurina. Las células se incubaron en estufa (5 % CO2/37 °C) durante dos horas. La viabilidad se determinó por espectrofotometría de fluorescencia a longitudes de onda ex535/em595 utilizando el lector de placas Beckman Coulter DTX 880. Análisis de síntesis de Cho: Se sembraron células en placas de petri Falcon de 100 mm (6 controles y 6 tratados con CuSO4 y luego del tratamiento de 24 hs se agregó acetato marcado radiactivamente (C4)/well para observar síntesis de novo. Se incubó por 6 hs y se realizó una extracción con hexano:isopropanol 3:1 y luego con Folch. Se saponificaron los lípidos 1 h a 80ºCcon KOH metílico, se sembraron en placa de TLC y la incorporación de acetato marcado se observó utilizando el equipo Storm 840 phospor imager. Las imágenes fueron analizadas con el software ImageJ.Determinación de Cho total: se analizó el Cho total por la técnica de charríng y posterior análisis utilizando software ImageJ. Niveles de HMGCoA reductasa (HMGCR): mediante western blot se analizó los niveles de HMGCR (Sta. Cruz biotechnology, K1616 y secundario anti-mouse de SIGMA -0168). Resultados: El IC50 para el CuSO4 es 1,23 m M. Siendo el objetivo evaluar in vitro el efecto del Cu sobre la vía del mevalonato en condiciones de sobrecarga de Cu que no alteren la viabilidad celular se eligió trabajar con 200 uM a lo largo de los experimentos.Se analizaron los niveles de Cu en el medio de cultivo y dentro de las células (en homogenatos) luego de 24 h de tratamiento. Los niveles de Cu disminuyeron en el medio de cultivo (p