Caracterización Biofísica de la interacción LPS-HDL. Importancia en la neutralización del shock séptico.

HENNING, MARÍA FLORENCIA; BAKÁS, LAURA

La Plata, Bs. As.

Jornada; Jornadas de medicina 2008; 2008

Facultad de Ciencias Médicas, UNLP,

El lipopolisacárido bacteriano (LPS), constituyente mayoritario de la membrana externa de las bacterias Gram negativas, es liberado desde la pared externa de las bacterias y una vez en circulación sistémica induce una serie de efectos fisiopatológicos que pueden culminar en shock séptico.  Se ha descripto que las lipoproteínas de alta densidad (HDL) pueden neutralizar y reducir el efecto endotóxico del LPS pero hasta el momento hay controversias respecto qué región de las HDL, lipídica o proteica (apo AI), es responsable del efecto neutralizante de la endotoxina. La caracterización de las regiones de interacción entre HDL y LPS es de importancia para el desarrollo de estrategias tendientes a reducir la producción de citoquinas inducida por el LPS en células mononucleares y en la defensa frente al shock séptico inducido por bacterias Gram negativas. Objetivos: Determinar, por medio de estudios biofísicos de la interacción LPS-HDL, un posible mecanismo de neutralización del LPS por HDL, con la finalidad de diseñar terapias alternativas ante el shock séptico. Materiales y métodos: LPS y LPS-FITC de E.coli 0111:B4, DMPC, POPC, DPPC, apo AI, Laurdan, DPH, NBD-PE, Rh-PE, SASD, 125I, NBS Metodología para el estudio de la interacción apo AI-LPS: Ensayos de micelización. Electroforesis en geles de poliacrilamida Tris-glicina y Tris-Tricina. Espectroscopia de fluorescencia de la apo AI. Desnaturalización química de la apo AI con GndHCl. Oxidación de Trp con NBS. Dicroísmo circular. Ensayos de FRET con ANS. Fluorescencia del ANS.  Ensayos de proteólisis con tripsina y CNBr. Ensayos de fotoactivación y cross-linking con 125I-ASD-LPS. Metodología para el estudio de la interacción membrana-LPS: MC 540, GP del Laurdan. Anisotropía del DPH. Medidas de potencial Z. Ensayos de FRET.  Fluorescencia de LPS-FITC. Microscopía de fluorescencia de dos fotones. Resultados: A partir de ensayos solubilización de liposomas por acción de la apo AI se observó que la presencia de LPS modifica la eficiencia del proceso. Debido a los efectos observados se estudió si el cambio observado en la funcionalidad de la apo AI es debido a la interacción del LPS con la proteína, con los lípidos o con ambos. Diferentes ensayos de fluorescencia (tanto intrínseca como utilizando sondas) demostraron que la interacción de la apo AI con el LPS genera cambios conformacionales en la proteína y que dicha interacción no ocurre en la región Nt, donde se encuentran la mayoría de los residuos Trp, utilizados como sensores. Ensayos de proteólisis apoyaron la hipótesis del cambio conformacional. Por medio de experimentos de CD se observó que la estructura secundaria de la proteína no cambia por la interacción con LPS y ensayos de desnaturalización química demostraron que la presencia de LPS favorece el desplegamiento de la proteína. Finalmente estudios preliminares Por medio de ensayos de corsslinking entre apo AI y 125I-ASD-LPS y de proteólisis química  indican que la porción central de la apo AI es la involucrada en la interacción con el LPS. También se demostró (por FRET, MC540 y Potencial Z) la intercalación de la toxina en sistemas modelo de membranas, indicando que el LPS es capaz de interactuar con los lípidos, independientemente de la presencia de LBP. Para determinar si esta intercalación modifica las propiedades de los lípidos, se analizaron por MC540, GP Laurdan y DPH las propiedades de fase de los fosfolípidos en presencia de LPS y fue demostrado que la toxina no modifica las propiedades de la membrana. Este efecto también se visualizó por microscopía de fluorescencia de dos fotones, observando una segregación del LPS en dominios de membrana. Conclusiones: A partir de los resultados expuestos se puede concluir que la capacidad neutralizante de las HDL se encuentra tanto en su región lipídica como en su porción proteica. Al insertarse el LPS (por medio del lípido A) en la porción lipídica de las HDL, presenta su región biológicamente activa (lípido A) a regiones de la apo AI que se encuentran expuestas e interactuando con lípidos de las HDL. Esta interacción entre la endotoxina y la proteína no ocurre con la apo AI en solución debido a que las porciones de apo AI que interaccionan con lípidos se encuentran formando un núcleo hidrofóbico no expuesto al solvente y por ende inaccesible al LPS. Probablemente LPS y apo AI se unan en solución por medio de interacciones electrostáticas pero este tipo de interacción no neutraliza la toxicidad del mismo ya que para eso es necesario neutralizar al lípido A, no sólo unir LPS. Es por eso que en las HDL se combinan las propiedades necesarias para unir apo AI-LPS y enmascarar al lípido A bloqueando su toxicidad.