Análisis de los factores que determinan la eficiencia de hemólisis de alfa-hemolisina de E. coli en glóbulos rojos de diferentes especies

JUAN LABORDE; VANESA HERLAX; SABINA MATÉ; LAURA BAKÁS

La Plata

Jornada; II Jornadas de la Fac. Ciencias Médicas de UNLP; 2008

Fac. Ciencias Médicas, UNLP

De las aproximadamente 350 toxinas proteicas producidas por bacterias Gram- negativas y Gram-positivas, al menos 35% pertenecen al grupo de las llamadas “Toxinas Membranolíticas”. La característica más saliente de estos efectores es la desorganización que producen en la bicapa fosfolipídica de la membrana plasmática de las “células blanco”. Dentro de uno de los 3 grandes grupos reconocidos se encuentran las toxinas RTX (Repeats in Toxin), cuyo miembro representativo  es alfa Hemolisina de Escherichia coli (HlyA). HlyA es una toxina proteica que ciertas cepas patógenas de E.coli secretan específicamente al medio. Está demostrado que la toxina es un factor importante de virulencia en enfermedades extraintestinales. HlyA actúa sobre un amplio espectro  de células atacando eritrocitos, granulocitos, monocitos, células endoteliales y células de epitelio renal de ratón, rumiantes y primates, entre otras especies. Esta amplia gama de células blanco sobre las que HlyA actúa, contribuye a la falta de entendimiento sobre la existencia o no de un receptor específico para esta toxina. Pueden existir múltiples razones para explicar que un tipo celular dado sea insensible a la toxina, ya que, la toxina puede no interactuar con la membrana, puede adsorberse en la superficie de la célula pero fallar la inserción en la membrana, o bien, el tipo celular en cuestión presentar un mecanismo de reparación de la lesión por lo que aparece como insensible a la toxina. Por lo expuesto se puede observar que todavía hay muchas incertidumbres en el mecanismo de acción de HlyA, es por eso que en este trabajo se trató de dilucidar cuales son los factores que determinan la eficiencia de hemólisis empleando eritrocitos de diferentes especies, conejo, caballo y carnero. En primer lugar comparamos la eficiencia de hemólisis por medida de los cambios de turbidez de la suspensión de eritrocitos tratados con HlyA. La comparación de las curvas obtenidas para los eritrocitos de las 3 especies estudiadas muestra un comportamiento dosis–respuesta similar, obteniéndose las mayores velocidades en todo el rango de concentraciones estudiado para eritrocitos de conejo. Sin embargo los datos de velocidad de hemólisis no miden la unión de la toxina a la membrana sino eventos posteriores a la unión, ya que la hemólisis es el resultado final del proceso. Una explicación para la diferente susceptibilidad de las células blanco a HlyA puede ser su reconocimiento por receptores específicos de membrana. Por este motivo es que se procedió a determinar el patrón de proteínas y en particular la presencia de glicoforina en eritrocitos de carnero, caballo y conejo. Una electroforesis de proteínas totales de fantasmas de eritrocitos de cada una de las especies muestra que la posición de las proteínas mayoritarias son similares en los eritrocitos de caballo y carnero. Empleando una tinción específica para glicoproteínas puede apreciarse una marcada diferencia entre especies, observando que a diferencia de eritrocitos de caballo y carnero, para eritrocitos de conejo no se aprecia una glicoproteína mayoritaria. Por western blot  empleando anticuerpos policlonales antiglicoforina, se revela una importante diferencia entre las 3 especies, apreciando una banda tenue para eritrocitos de caballo, ausencia de banda correspondiente a glicoforina en carnero y una intensa banda se observa en el caso de membranas de eritrocitos de conejo. Esto podría explicar el orden de susceptibilidad hacia HlyA de los eritrocitos de las especies estudiadas.     Por otro lado, la composición lipídica de los fantasmas de los eritrocitos de las 3 especies estudiadas por cromatografía en capa fina (TLC) mostró una importante diferencia en el contenido de esfingomielina (SM), pero no así en el contenido de colesterol. Además fue llamativo, la ausencia de fosfatidilcolina entre los lípidos de fantasmas de carnero. La relación COL/SM es 11, 2 y 6 para fantasmas de caballo, carnero y conejo respectivamente. La correlación con la susceptibilidad de los eritrocitos empleados con la relación CHOL/SM estaría indicando  que existe una relación crítica entre estas especies lipídicas para una mayor eficiencia de hemólisis de HlyA.     En conclusión, la diferente susceptibilidad de HlyA a los distintos eritrocitos podría estar relacionado con la concentración de receptores en la membrana. Estos receptores pueden ser glicoforina o algún fosfolípido de membrana que este actuando como receptor de baja afinidad, pero dado que su elevado número de sitios de unión promueven una alta eficiencia lítica.