Metil-betaciclodextrina extrae selectivamente el colesterol de membranas de eritrocitos

SABINA MATÉ; VANESA HERLAX; JOSEFA TACCONI DE ALANIZ; LAURA BAKÁS

La Plata

Jornada; II Jornadas de la Fac. Ciencias Médicas de UNLP; 2008

Fac. Ciencias Médicas, UNLP

Introducción: los membrane rafts son dominios de membrana pequeños (10-200 nm), heterogéneos, altamente dinámicos, enriquecidos en colesterol y esfingolípidos, estabilizados por interacciones proteína-proteína y lípido -proteína que intervienen en la compartamentalización de determinados procesos celulares. En la bibliografía está ampliamente documentada la utilización de metil-b-ciclodextrina (b-CD) u otras drogas que extraen el colesterol celular desestabilizando los rafts como metodología para inferir la participación de membrane rafts en numerosos procesos de membrana. Pero qué significa “desestabilizar” dichos microdominos? Alterar su composición lipídica y proteica característica? Objetivos: determinar los cambios producidos en la composición lipídica y proteica características de membrane rafts de eritrocitos de carnero mediante el uso de b-CD. Materiales y métodos:  - los eritrocitos se incubaron durante 18 hs en presencia de [4-14C]colesterol, a 37 ºC y sin agitación. Finalizada la incubación los eritrocitos se lavaron para eliminar el colesterol no incorporado y se incubaron en presencia de b-CD 3 mM durante 30 min a 37ºC. Los controles se incubaron en idénticas condiciones pero en presencia de buffer, sin b-CD. - se obtuvieron los fantasmas de eritrocitos tratados como se describió más arriba. - se utilizó la técnica de membranas resistentes a detergentes (DRMs) como aproximación metodológica para trabajar con membrane rafts. Esta técnica consiste en el lisado de las muestras (fantasmas de eritrocitos) con TX-100 1 %, en frío,  seguido de ultracentrifugación del lisado en gradiente discontínuo de sacarosa (40-35-5%).  Se colectaron 13 fracciones en total. Las DRMs, de baja densidad, se colectan de la interfase entre los colchones de sacarosa 5 – 35 % (fracciones 3 a 5). El resto de las membranas solubilizadas por el detergente quedan en el fondo del tubo. - se determinó la radiactividad incorporada en cada fracción mediante conteo por centelleo líquido, la composición lipídica de las DRM mediante HPTLC y  la presencia de proteínas marcadoras de rafts mediante western blot. Resultados: - se chequeó la técnica de DRMs mediante la determinación del contenido de colesterol y esfingomielina en todas la fracciones de ultracentrífuga.  Se observó que  las fracciones correspondientes a DRMs presentan un enriqueciminento característico en colesterol y esfingomielina. - se chequeó la técnica de DRMs mediante el análisis de la presencia/ausencia de proteína marcadora de rafts en todas las fracciones de ultracentrífuga. Se determinó la presencia de flotilina (proteína marcadora de rafts en eritrocitos) en las fracciones correspondientes a DRMs. - se observó que el tratamiento de los eritrocitos con  b-CD provoca la desaparición de la proteína marcadora de rafts de las fracciones correspondientes a DRMs. - se determinó la incorporación de colesterol radiactivo en las fracciones correspondientes a DRMs siendo  un 50 % menor en eritrocitos tratados con b-CD que en eritrocitos control. Conclusiones: -El tratamiento de los eritrocitos con b-CD produce alteraciones tanto en la composición lipídica como proteica características de las DRMs -El marcado de eritrocitos con  [4-14C]colesterol constituye un método simple y económico para la cuantificación del colesterol en las diferentes fracciones de las membranas de eritrocitos. Perspectivas: Determinar  si  b-CD extrae colesterol selectivamente de las fracciones correspondientes a DRMs obtenidos de membranas independientemente de la relación esfingomielina/colesterol de las mismas.