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Alfa hemolisina (HlyA), miembro representativo de la familia de toxinas RTX (Repeat in toxin), es una toxina proteica que ciertas cepas patógenas de E.coli secretan específicamente al medio. Está demostrado que la toxina es un factor importante de virulencia en enfermedades extraintestinales. Además, se ha determinado que el desarrollo de falla renal aguda aumenta significativamente la mortalidad en pacientes con shock séptico producido por bacterias Gram negativas, en los que distintos factores de virulencia, entre ellos hemolisina, contribuyen al desarrollo de la sepsis inducida por E.coli. Como otras proteínas de la familia RTX, un operón compuesto por 4 genes (hlyABCD) es responsable de la síntesis, activación por maduración postraduccional y secreción de la toxina activa. El gen estructural hlyA da lugar a la proteína de 1024 aminoácidos que no es tóxica hasta que es activada intracelularmente por el producto del gen hlyC, una acil transferasa que une covalentemente ácidos grasos a dos residuos internos de lisina (K563 y K689). Luego HlyA se secreta al medio por una ruta de transporte específica formada por HlyB, HlyD y TolC. El mecanismo preciso por el cual las toxinas RTX y en particular HlyA mata a las células in vivo no está aún completamente dilucidado. Esta toxina presenta un amplio espectro respecto a las células blanco, atacando células de varios tipos como fibroblastos, células endoteliales, granulocitos, monocitos, macrófagos y eritrocitos de diferentes especies. Como línea de trabajo nos propusimos estudiar el mecanismo de acción de la toxina desde su excreción hasta su unión a las células diana, eligiendo como modelo los eritrocitos. A continuación presento resultados sobre el rol de los ácidos grasos unidos covalentemente a la toxina. Primero realizamos una caracterización fisicoquímica de los cambios estructurales que la presencia de los ácidos grasos produce en la proteína en su forma soluble. Los resultados obtenidos a través de la caracterización del proceso de desnaturalización química, los parámetros de unión de la sonda ANS (Kd and n) y experimentos de digestión controlada con proteasas son consistentes con una conformación de tipo glóbulo fundido inducida por la presencia de los ácidos grasos. Además, empleando predictores de regiones intrínsecamente desordenadas, encontramos que HlyA contiene 9 de tales regiones, las que podrían exponerse gracias a la conformación de glóbulo fundido inducido por los ácidos grasos. Estas regiones serian responsables de la propiedad de HlyA de unirse a gran variedad de moléculas durante su mecanismo de acción. Por otro lado, resultados obtenidos a partir de experimentos de FRET de mutantes de cisteína de HlyA marcados con dos fluoróforos, indican la oligomerización de la toxina cuando ésta se encuentra unida a la membrana de eritrocitos de carnero. Además, medidas de FRET y cinética de hemólisis en eritrocitos deplecionados de colesterol indican que es la integridad de los microdominios enriquecidos en colesterol presentes en la membrana del eritrocito, los que promueven el proceso de oligomerización el cual está directamente relacionado con e proceso de hemólisis. Para profundizar aún mas en el proceso de oligomerización hemos aislado membranas resistentes a detergentes por ultracentrifugación en sacarosa, donde encontramos que tanto la toxina acilada como la no acilada se unen a estas regiones de la membrana. Sumado a que se observó por FRET que la proteína no acilada no oligomeriza, podemos concluir que los ácidos grasos no son necesarios para la unión a la membrana pero si para promover la oligomerización. En conclusión, los ácidos grasos unidos covalentemente a la toxina inducen un cambio conformacional que promueve la oligomerización de la toxina en la membrana, probablemente por la exposición de regiones intrínsecamente desordenados. Dicha oligomerización se ve favorecida en presencia de microdominios enriquecidos en colesterol presentes en la membrana de la célula.