Estudio del rol de los triptófanos en la estructura y función de la alfa hemolisina de E. col

ROMINA VAZQUEZ; VANESA HERLAX

Encuentro; Reunión de la Asociación Universitaria del grupo Montevideo (AUGM); 2012

Alfa hemolisina (HlyA) de Escherichia coli constituye un importante factor de virulencia producido por cepas causantes de más del 50% de las infecciones extraintestinales en humanos. Es sintetizada como un polipéptido de 110 kDa que constituye la protoxina inactiva (proHlyA) que es transformada en el citosol a su forma activa mediante acilación dirigida por HlyC en dos residuos de lisina internos (K564 y K690). En cuanto a la interacción con las células blanco, existen distintas fases en la citotoxicidad de HlyA: una fase de adsorción pasiva a la superficie de la célula, luego una fase de inserción a la membrana y por último ocurre un proceso de oligomerización que lleva a la formación del poro. HlyA posee en su secuencia cuatro triptófanos localizados en las posiciones 431, 479, 578 y 913. Estudios previos indican que la oxidación de los triptófanos expuestos al solvente con N-bromosuccinimida (NBS) lleva a una pérdida de la actividad lítica de HlyA, indicando que alguno o algunos de estos residuos son imprescindibles en algún paso del proceso hemolítico. Por lo anteriormente expuesto el objetivo de este trabajo es estudiar el rol de los triptófanos en la estructura y función de HlyA. Para ello se utilizaron mutantes puntuales donde uno de los cuatro triptófanos (W) fue reemplazado por cisteína (C): W431C, W479C; W578C y W913C. Se midió la actividad hemolítica de la HlyA y de los mutantes de W y se obtuvieron sus espectros de fluorescencia intrínseca. Se determinó el porcentaje de unión a membranas por Western Blot y se analizó la reversibilidad de la unión mediante transferencia de las proteínas unidas a MLV de POPC a LUV de doxilo-POPC. Por último se estudió la ubicación de los W en la forma soluble de HlyA por la susceptibilidad que presentan los mismos a ser oxidados con NBS. Los resultados muestran que el mutante W578C es el único inactivo, indicando que el W578 estaría involucrado en algún paso del proceso hemolítico. Todos los mutantes de W presentan en sus espectros de fluorescencia normalizados un corrimiento del máximo de fluorescencia hacia mayores longitudes de onda indicando la presencia de una estructura más desplegada comparada con la nativa, pero que no afecta la funcionalidad de la proteína, ya que sólo uno de los ellos es inactivo. Tanto HlyA como todos los mutantes de W se unen a fantasmas de eritrocitos de carnero, sin embargo, el mutante W578C lo hace de manera reversible. En los ensayos de oxidación con NBS se observa que los W479 y W913 son más fácilmente oxidados que W431 y W578. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que de los cuatro W presentes en la secuencia de HlyA sólo el W578 sería esencial para la actividad lítica de la toxina. Si bien la ausencia de cualquiera de ellos produce un desplegamiento de la proteína, en el caso de los W431, W479 y W931, este cambio conformacional no produce pérdida de la actividad hemolítica. La unión a la membrana no es el paso crítico afectado por la ausencia del W578, ya que todos los mutantes se unen a fantasmas de eritrocitos de carnero. Una vez que la toxina se une a la membrana ocurren cambios conformacionales que llevan a la inserción de la toxina y posterior oligomerización de la misma, lo que hace que la unión sea irreversible. El W578 podría estar implicado en alguno de estos procesos ya que su ausencia hace que la toxina no pueda unirse de manera irreversible a las membranas. El estudio de los residuos de W expuestos al solvente indica que el W578 se encontraría hacia el interior de la proteína. Estudios previos indican que la unión a la membrana produce un cambio conformacional que expone zonas intrínsecamente desordenadas promoviendo la interacción proteína-proteína. El W578 podría estar involucrado en este proceso, estando inicialmente hacia el interior de la proteína y una vez que ésta se une a la membrana quedando expuesto promoviendo la oligomerización y por lo tanto, la formación del poro.