CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE UN ADENOVECTOR BAJO UN SISTEMA BIVECTORAL BIDIRECCIONAL REGULABLE PARA TRATAMIENTO DEL DEFICIT COGNITIVO DEPENDIENTE DE HIPOCAMPO

COLL L; MOREL GR

Curitiba

Jornada; XX Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Asociación de Universidades de Grupo Montevideo (AUGM); 2012

Asociación de Universidades de Grupo Montevideo (AUGM)

El envejecimiento está asociado a un progresivo aumento de la incidencia de enfermedades neurodegenerativas caracterizadas por la pérdida neuronal selectiva y progresiva, siendo una de las regiones más afectadas el hipocampo, lo que se refleja en la aparición de disfuncionalidades tales como alteraciones en los procesos de memoria y aprendizaje, signos característicos de la enfermedad de Alzheimer. El factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) ha sido estudiado por sus efectos beneficiosos contra la atrofia neuronal que causa el déficit cognitivo en la vejez. En nuestro laboratorio se ha caracterizado a la rata hembra senil Sprague-Dawley de 32 meses como un modelo válido de neurodegeneración espontánea con la edad. Recientemente, hemos caracterizado la aptitud cognitiva de estos animales empleando un test de memoria espacial, el laberinto de Barnes, observando un importante déficit cognitivo en los animales seniles de 32 meses de edad cuando se los compara con animales jóvenes de 6 meses de edad. Con el objetivo futuro de realizar terapia génica neuroprotectora para GDNF en la región CA1 del hipocampo de ratas seniles, con la necesidad imperativa de emplear vectores adenovirales más seguros y que su expresión pueda ser regulada y monitoreada rápidamente, se procedió a la construcción y caracterización de un adenovector bivectorial regulable que expresa simultáneamente los transgenes para la green fluorescent protein (GFP) y para GDNF de rata (rGDNF). Dicho sistema consta de dos componentes: la unidad de respuesta, en la cual la transcripción de los transgenes se encuentra controlada por un promotor bidireccional regulado negativamente por doxiciclina (Dox), y la unidad transactivadora, que expresa la proteína regulatoria tTA. Cada uno de ellos es aportado por un adenovector recombinante independiente (RAd); RAdGPFTREGDNF para la unidad de respuesta y RAdtTA para la unidad transactivadora. Nuestro objetivo fue determinar la expresión y regulabilidad del sistema bivectorial in vitro e in vivo a través de la expresión de GFP. Para el estudio de la expresión in vitro se trabajó con células de ovario de hámster chino (CHO-K1), variando las multiplicidades de infección (MOI), empleando una MOI de 10, 100 y 1000, donde una MOI de 10, corresponde a 10 partículas virales por célula, utilizando diferentes relaciones del RAdtTA/RAdGPFTREGDNF en proporciones 1:1, 1:10 y 10:1. Los resultados mostraron que el sistema es activo en células CHO-K1 con diferencias significativas en la expresión del transgen únicamente para una MOI de 1000 a una relación 10:1 de RAdtTA/RAdGPFTREGDNF. Basándonos en el ensayo de expresión, en el experimento de regulabilidad in vitro se empleó una MOI de 1000 a una relación 10:1 del sistema bivectorial utilizando diferentes concentraciones de Dox (0,01; 0,1; 1 y 1,5 µg/ml). La exposición a la menor concentración de Dox fue suficiente para inhibir la expresión de GFP, lo cual se determinó midiendo la intensidad de fluorescencia por fluorometría. Para el estudio de la expresión in vivo se realizaron inyecciones estereotáxicas en el área CA1 del hipocampo y en ventrículo lateral (VL) de ratas machos Sprague-Dawley de 6 meses de edad con el sistema RAdGFPTREGDNF/RAdtTA. A los dos días post-inyección se procedió a sacrificar los animales a fin de evaluar la distribución y nivel de expresión a corto plazo del transgen GFP en las dos zonas antes mencionadas mediante microscopía de fluorescencia, observándose una marcada expresión de GFP en las células ependimarias y células neurales. Para el ensayo de la regulabilidad in vivo se utilizaron dos grupos de animales (grupo control y grupo tratado con Dox) a los cuales se les realizó una inyección estereotáxica de los adenovectores en el área CA1 del hipocampo. A los animales tratados se les administró en el agua de bebida Dox en una concentración de 1mg/ml 24hs. previas a la inyección y durante las 48hs. subsiguientes. A los dos días post-inyección se procedió a sacrificar los animales a fin de evaluar la regulación por Dox mediante la observación microscópica de la expresión de GFP en los dos grupos de animales, resultando una inhibición completa de la expresión del transgen en la región CA1 hipocampal. Considerando que los efectos secundarios del GDNF, cuando se lo inyecta en el hipotálamo, es la reducción en la ganancia de peso, procedimos a evaluar la actividad biológica del GDNF en éste área, para lo cual los animales fueron pesados y colocados en dos grupos experimentales (control y tratados con GDNF). A los animales tratados se les realizó una inyección estereotáxica en el hipotálamo con el sistema RAdtTA/RAdGPFTREGDNF mientras que en los animales control se les inyectó el sistema RAdtTA/RAdGPFTRE en el mismo área. Los pesos se midieron cada 48hs. durante 27 días. Después de la inyección, los dos grupos mostraron una disminución en el peso corporal durante los primeros días después de la cirugía estereotáxica, probablemente como una respuesta a la intervención quirúrgica. Se pudo observar, como se esperaba, que el GDNF transgénico en los animales tratados provocó un retardo en la ganancia de peso hasta el día 21 post-inyección, mientras que los animales controles recuperaron su peso a los 15 días post-inyección, lo cual constituye un conveniente índice de actividad biológica del transgén y permite un seguimiento longitudinal fácil y no invasivo de la efectividad del tratamiento. Estos resultados nos permiten sugerir al sistema bivectorial regulable RAdGFPTREGDNF/RAdtTA útil para comprobar de forma rápida y sencilla la expresión del vector a través del gen reportero GFP. Por otra parte, el GDNF es un candidato promisorio para la implementación de terapia génica neuroprotectora en la región CA1 del hipocampo en ratas seniles con déficit de memoria espacial y de esta manera se podrá evaluar la posible mejora con el tratamiento.