Optimización del ensayo cometa Mediante la utilización de Microgeles únicos Comet assay: optimization by unique microgels

CRESPO ROSANA; RICARD MARCOS; GARCÍA DE BRAVO MARGARITA; GÜERCI, ALBA

Tandil

Congreso; XVII Congreso Argentino de Toxicología; 2011

Asociación Toxicológica Argentina

Dentro de las metodologías utilizadas en el ámbito de la Genética Toxicológica el Ensayo Cometa es reconocido por su sensibilidad, simpleza, rapidez y bajo costo. Así, es ampliamente utilizado para evaluar el daño genotóxico inducido por distintos agentes y su atención en mutagénesis y biomonitoreo ambiental parece incrementarse con el desarrollo de las continuas mejoras que se van desarrollando. No obstante, uno de los puntos críticos es la inhomogeneidad de la efectroforesis que aporta variabilidad a los resultados y también la preparación de los microgeles respectivos. Se propone un nuevo protocolo como alternativa sencilla y económica a las presentes en punta. El diseño reside en ubicar la totalidad de las muestras del experimento en un soloun solo gel de manera de compensar la utilización de materiales costosos y la preparación de geles individuales para cada punto. Todas las muestras son sembradas dentro del mismo soporte y por ende se evitan las heterogeneidades consecuentes que pueden ser importantes al momento de interpretar los resultados considerando la sensibilidad extrema de la técnica y la variabilidad electroforética intrínseca. El diseño fue implementado sobre diferentes líneas celulares utilizadas en el área (CHO-K1; A549; HepG2 y Jurkat). Mediante 5 entradas experimentales se ajustaron los siguientes parámetros: 1) Volumen de siembra; 2) Número de puntos por gel; 3) Densidad Celular. La detección de daño inducido con 6 Gy de rayos X, y con controles negativo se realizó con la versión alcalina de la técnica de acuerdo al método de Singh y colaboradores (1988) con las modificaciones en la preparación de los geles aludidas previamente. El mejor arreglo se obtuvo disponiendo 8 puntos en dos hileras. El volumen óptimo de siembra fue de 16 μl finales con 1000 células De esta manera se logra individualización de puntos adyacentes y no superposición de cometas dentro de los campos de observación. Así, y desde una perspectiva estricta de la exigencia experimental el protocolo propuesto permitiría eliminar la variabilidad intergeles, que contribuye muchas veces de manera sustancial a la falta de homogeneidad en el tratamiento de las muestras.