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La papaína (EC 3.4.22.2) es una endopeptidasa cisteínica proveniente de Carica papaya muy empleada en diversas aplicaciones biotecnológicas. Además de hidrolizar proteínas, puede catalizar reacciones de formación de enlaces amida y éster en medios conteniendo altas proporciones de solventes orgánicos. La comprensión de su estabilidad estructural tiene gran importancia a fin de optimizar la actividad enzimática en estos medios. En este contexto, se estudió el efecto de medios con altas proporciones (90 y 99%) de solventes orgánicos miscibles, acetonitrilo (ACN) y metanol (MeOH) sobre la estabilidad estructural y biológica de la papaína pura. Se analizó la influencia de dichos solventes sobre la conformación de papaína mediante estudios de fluorescencia. Los cambios en la estructura secundaria se estudiaron mediante el intercambio isotópico de la enzima con D2O y análisis infrarrojo in situ por Reflexión Total Atenuada ATR. Simultáneamente, se probó la actividad proteolítica remanente de la enzima luego de 1 y 24 hs de incubación en dichos medios. Los resultados revelaron que la estructura de la papaína prácticamente no sería alterada por el ACN. Luego de 24 hs de incubación, la actividad residual obtenida fue superior al 90% en presencia de dicho solvente. Los estudios espectroscópicos evidenciaron que no hubo cambios significativos en la estructura secundaria ni terciaria de la enzima. Por su parte, el MeOH provocó una marcada disminución de la actividad inicial de papaína (~ 20-50%). El análisis de la estructura secundaria de la enzima tratada en MeOH 99%, evidenció la disminución del porcentaje de hélice α y el aumento de la estructura desordenada.