SILENCIAMIENTO DEL INTERCAMBIADOR SODIO/HIDRÓGENO (NHE1) EN CORAZÓN DE RATÓN CON siRNA DESNUDO

CORREA MARÍA V; PÉREZ NÉSTOR G; CINGOLANI HORACIO E; MORGAN PATRICIO E

Mar del Plata

Congreso; Congreso de SAFIS; 2010

Patologías cardíacas como el daño por isquemia/reperfusión, hipertrofia e insuficiencia cardiaca han sido asociadas con la hiperactividad del NHE1. En este trabajo se generó siRNA in vitro para reducir específicamente la expresión del NHE1. Como control se generó siRNA con la misma secuencia organizada de manera aleatoria (siRNASCR). La efectividad del siRNA se estudio en células HEK293 que fueron co-transfectadas con una cantidad constante de NHE1 cDNA (1.6 mg) y cantidades crecientes siRNANHE1 (mg): 0, 1, 4, 10, 40. Para las cantidades antes mencionadas y control (siRNASCR) se redujo la expresión del NHE1 respectivamente: 100; 52.5 ± 3.8; 31.7 ± 3.6; 19.7 ± 3; 9.6  ± 4.9; 87.9 ± 20.3 (n=3 cada uno, ANOVA One-way p<0.05). Luego, se inyectó siRNA (20 mg)  en el apex de la pared antero-lateral del ventrículo izquierdo del corazón de ratones. Posteriormente fueron sacrificados luego de 48 y 72 hs, se les extrajo el corazón y se midió la expresión proteica en inmunoblots. La expresión del NHE1 se redujo en presencia de siRNANHE1 (33.2 ± 3.4 % n=5) comparado con los ratones inyectados con siRNASCR (100 ± 11.2 % n=5; p<0.05). En contraste, la expresión el NHE1 en lisados de hígado de los mismos animales no mostró diferencias significativas. Luego, se estudió la expresión del NHE1 en tres partes del corazón: apex, parte media y base. La expresión del NHE1 (NHE1/GAPDH) mostró una reducción extendida en todo el corazón en relación con  siRNASCR (1.43 ± 0.09, n=3): Apex 0.15 ± 0.03, n=3; Medio 0.33 ± 0.14, n=3; Base 0.42 ± 0.25 n=3; (P<0.05 ANOVA, todos vs siRNASCR). Finalmente, se estudió la actividad del NHE1 en músculos papilares aislados de ventrículo izquierdo a través de la recuperación del pHi luego de una carga ácida aguda. Los experimentos se hicieron en un medio libre de bicarbonato (buffer HEPES) para garantizar que la recuperación del pHi fuera debida solo al NHE1. Los ratones inyectados con siRNANHE1 tuvieron una reducción de la actividad del NHE1 (dpHi/dt) comparada con los ratones inyectados con siRNASCR (0.021 ± 0.01 vs 0.132 ± 0.013 pH/min, n=4,  P<0.05). Concluimos que la inoculación de RNA de interferencia en un solo lugar en el miocardio es suficiente para reducir la expresión del NHE1 en todo el ventrículo izquierdo, posiblemente a través del sincitio miocárdico.