Interacción física y funcional de la anhidrasa carbónica con la isoforma electrogénica NBC1 del cotransportardor Na+/HCO3- cardíaco.

ORLOWSKI A; DE GIUSTI VC; ÁLVAREZ BV; AIELLO EA

Pucón (Chile)

Congreso; XXIII Congreso Asociación Latinoamericana de Ciencias Fisiológicas. 16th Symposium on Ca2+ binding proteins and Ca2+ function in health and disease; 2009

Asociación Latinoamericana de Ciencias Fisiológicas

Evidencia de interacción física y funcional de la anhidrasa carbónica con la isoforma electrogénica NBC1 del cotransportador Na+/HCO3-  cardíaco.  Orlowski A, De Giusti VC, Álvarez BV, Aiello EA. Centro de Investigaciones  Cardiovasculares; Facultad de Ciencias Médicas de La Plata; UNLP. El bicarbonato (HCO3-) es el principal buffer de nuestro organismo. Nuestras células controlan la concentración y el movimiento de HCO3- a través de la membrana plasmática, en procesos mediados por la anhidrasa carbónica (AC), y el transporte mediado por proteínas transportadoras de HCO3-. Entre estas últimas, el cotransportador Na+/HCO3- (NBC) juega un rol fundamental en el reestablecimiento del pH intracelular (pHi) ante la acidificación de los miocitos cardíacos. La AC cataliza la conversión reversible del ácido carbónico en HCO3- y H+. Nosotros hipotetizamos que este HCO3- sirve directamente de sustrato para el NBC. Por lo tanto proponemos que la isoforma electrogénica del NBC denominada NBC1 forma un complejo físico y funcional con la AC. En western blots (WB) de lisados de corazón de rata (LCR) encontramos que en este tejido se expresan 4 isoformas de la AC (ACII, ACIV, ACIX y ACXIV) y el NBC1. En ensayos de co-inmuno-precipitación, en los cuales se inmuno-precipitaron los LCR con anticuerpos específicos para las AC y se revelaron los WB con un anticuerpo específico contra el lazo extracelular III del NBC1 (ECIII), determinamos la interacción física del NBC1 con ACII, ACIV, ACIX o ACXIV. Para medir la actividad del NBC1 se realizaron experimentos de epifluorescencia en miocitos ventriculares de rata, cargados con el indicador de pH BCECF, sometidos a una despolarización del potencial de membrana mediante la elevación del K+ extracelular desde 4.5 a 45 mM (pulso de K+), destinada a incrementar la fuerza impulsora del NBC1. Los datos se expresan como aumento de unidades de pHi luego de 10 minutos de aplicado el pulso de K+; * indica p<0.05 por ANOVA ó t de Student, según corresponda. En miocitos tratados con suero SHAM (no-inmune, dilución 1/500), el pulso de K+ indujo un aumento del pHi de 0.14±0.04 (n=3). Este efecto fue anulado por el suero conteniendo ECIII (0.016±0.023, n=5*), indicando que este anticuerpo funciona como inhibidor selectivo del NBC1 y que este transportador es el único NBC electrogénico presente en los miocitos de rata.  Para estudiar la interacción funcional entre el NBC1 y la AC, repetimos los pulsos de K+ en presencia y ausencia de bloqueantes de la AC, etoxizolamida (ETZ) y benzolamida (BZ). El incremento de pHi control (0.165±0.017, n=11) fue inhibido significativamente por ETZ 100 mM (0.053±0.014, n=7*) y BZ 100 mM (0.090±0.025, n=6*). Estos resultados demuestran por primera vez la presencia en miocitos cardíacos de una interacción física y funcional del NBC con la AC, sugiriendo que ambas proteínas funcionan acopladas (“metabolón”) para optimizar de modo más eficiente el transporte transmembrana de HCO3- en la célula cardíaca.