CIC   05421
CENTRO DE INVESTIGACIONES CARDIOVASCULARES "DR. HORACIO EUGENIO CINGOLANI"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Silenciamiento génico del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Evidencia de inhibición funcional en miocardio
Autor/es:
BREA MS, DÍAZ RG, MORGAN PE
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Congreso; REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE FISIOLOGÍA (SAFIS); 2015
Resumen:
Es conocido que lasobrecarga hemodinámica genera hipertrofia cardíaca (HC), fenómeno que se hainterpretado clásicamente como una respuesta adaptativa (compensatoria) delmiocardio ante el aumento del estrés parietal. Sin embargo, ese concepto hasido abandonando ante la aparición de evidencias científicas que demuestran quela HC, cualquiera sea su origen, es per seun factor de riesgo de enfermedad y muerte de origen cardiovascular1. En este nuevo escenario, la caracterización de lasvías de señalización que la generan constituye un paso previo crucial para eldesarrollo de nuevas alternativas terapéuticas para combatirla y/o prevenirla.Entre los diversos factores que pueden inducir HC se encuentra la angiotensinaII (AngII), conocido agente pro-hipertrófico que el miocardio produce y liberaante una sobrecarga hemodinámica que el corazón detecta por el estiramiento desu pared2, desencadenando en el propio cardiomiocito señalesintracelulares que sostenidas crónicamente producirán HC. La secuencia exactade mediadores que llevan a la HC no está plenamente dilucidada, habiéndose focalizadola atención en las especies reactivas del oxígeno (ROS)3, 4 como posibles mediadoras de la activación por AngII del intercambiador Na+/H+miocárdico (NHE1), indicado como efector clave para el desarrollo de HC5, 6. En la búsqueda de señales precoces que pudieranconducir a HC, experimentos previos de nuestro laboratorio en músculospapilares aislados de ventrículo de rata sometidos a un estiramiento súbito noshan permitido sugerir que la transactivación del receptor del factor decrecimiento epidérmico (EGFR) sería clave para la generación de ROS porAngII7, lo cual hace pensar que de sostenerse esta señalcrónicamente generará HC. Dado que en el corazónse expresan otros dos receptores de la misma familia, ErbB2 y ErbB4, quepodrían ser afectados en su actividad por los inhibidores farmacológicos, surgela necesidad de crear una herramienta sumamente específica para inhibir al EGFRy así evaluar su posible rol en la HC. En vista de esto, desarrollamos unlentivirus de 3ra generación portador de un RNA de interferencia contrael EGFR (siRNA-EGFR). La estrategia para la producción de vectores lentiviralesconsiste en separar los distintos elementos virales necesarios para suformación en 4 plásmidos diferentes: el vector de transferencia del transgen (siRNA-EGFRo la secuencia scramble, siRNA-SCR) y 3 vectores de empaquetamiento (VSV, REV yRRE) que contienen la información para las proteínas de la superficie viral,estructurales y regulatorias. Para producir el virus se co-transfectaroncélulas HEK293T con los vectores empaquetadores y el vector de transferenciacon el siRNA-EGFR o siRNA-SCR, mediante el método del fosfato de calcio. Serecolectó el medio (que contiene las partículas virales liberadas por lascélulas) a las 24, 48 y 72 hs post transfección, y se purificó y concentró elvirus por ultracentrifugación. Para la determinación del título se transdujeroncélulas HEK293T con diluciones seriadas de la suspensión viral, y se contaroncélulas fluoresncentes, dado que el vector de transferencia posee el gen quecodifica para la proteína fluorescente roja. El título final se estimó en 1x108TU/ml.  Para probar in vitrola capacidad silenciadora del siRNA, se co-transfectaron células HEK293Tcon un plásmido que codifica para el EGFR de rata acoplado a la proteínafluorescente verde (GFP) y con el vector de transferencia que expresa el siRNA-SCRo el siRNA-EGFR. A igual cantidad de células rojas (es decir que incorporaronel vector codificante del siRNA), las placas con siRNA-SCR tuvieron más célulasverdes (expresan EGFR-GFP) que aquellas con siRNA-EGFR, donde el silenciamientodel receptor disminuyó la expresión de GFP. Seguidamente inyectamos enmiocardio de ratas Wistar siRNA-EGFR (n=5) o siRNA-SCR (n=4). Para lainyección, se practicó toracotomía entre el 4to y 5to espacio intercostal, bajoanestesia general para exponer el corazón. Se inyectó un volumen de 200 μl endos sitios de la pared antero-lateral del ventrículo izquierdo con jeringa deinsulina y aguja de 30G. Un mes después comprobamos por western blot enhomogenatos de ventrículo izquierdo una reducción significativa del EGFR en animalescon siRNA-EGFR (48±15 vs. 100±6%, P<0.05). Con la idea de probar suefectividad como inhibidor funcional del EGFR y dado que este es parte de la rutaque genera la segunda fase de fuerza (SFF) post-estiramiento miocárdico,quisimos probar si el siRNA-EGFR era capaz de inhibir la SFF en músculospapilares aislados. La SFF fue cancelada en músculos con siRNA-EGFR [en % de lafase rápida inicial: 102±1 vs. 131±2 (siRNA-SCR), P<0.05].Los resultados muestran que una reducción a la mitad de la expresión de EGFR alcanzapara cancelar su función confirmando que es una herramienta efectiva paraevaluar el rol del EGFR en el desarrollo de HC. 
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