CIC   05421
CENTRO DE INVESTIGACIONES CARDIOVASCULARES "DR. HORACIO EUGENIO CINGOLANI"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Silenciamiento génico del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Evidencia de inhibición funcional en el miocardio.
Autor/es:
BREA MS; DIAZ RG; MORGAN PE
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Congreso; LX Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC)-Reunión Científica 2015 de la Sociedad Argentina de Fisiología (SAFIS); 2015
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Investigación Clínica (SAIC)-Sociedad Argentina de Fisiología (SAFIS)
Resumen:
Es conocido que la sobrecarga hemodinámica genera hipertrofia cardíaca (HC), fenómeno que se ha interpretado clásicamente como una respuesta adaptativa (compensatoria) del miocardio ante el aumento del estrés parietal. Sin embargo, ese concepto ha sido abandonando ante la aparición de evidencias científicas que demuestran que la HC, cualquiera sea su origen, es per se un factor de riesgo de enfermedad y muerte de origen cardiovascular1. En este nuevo escenario, la caracterización de las vías de señalización que la generan constituye un paso previo crucial para el desarrollo de nuevas alternativas terapéuticas para combatirla y/o prevenirla. Entre los diversos factores que pueden inducir HC se encuentra la angiotensina II (AngII), conocido agente pro-hipertrófico que el miocardio produce y libera ante una sobrecarga hemodinámica que el corazón detecta por el estiramiento de su pared2, desencadenando en el propio cardiomiocito señales intracelulares que sostenidas crónicamente producirán HC. La secuencia exacta de mediadores que llevan a la HC no está plenamente dilucidada, habiéndose focalizado la atención en las especies reactivas del oxígeno (ROS)3, 4 como posibles mediadoras de la activación por AngII del intercambiador Na+/H+ miocárdico (NHE1), indicado como efector clave para el desarrollo de HC5, 6. En la búsqueda de señales precoces que pudieran conducir a HC, experimentos previos de nuestro laboratorio en músculos papilares aislados de ventrículo de rata sometidos a un estiramiento súbito nos han permitido sugerir que la transactivación del EGFR sería clave para la generación de ROS por AngII7, lo cual hace pensar que de sostenerse crónicamente esta señal generará HC. Dado que en el corazón se expresan otros dos receptores de la misma familia, ErbB2 y ErbB4, que podrían ser afectados en su actividad por los inhibidores farmacológicos, surge la necesidad de crear una herramienta sumamente específica para inhibir al EGFR y así evaluar su posible rol en la HC. En vista de esto, desarrollamos un lentivirus de 3ra generación portador de un RNA de interferencia contra el EGFR (siRNA-EGFR).La estrategia para la producción de lentivirus y la titulación de los mismos se resume escuetamente en la Figura 1A. Brevemente, consiste en separar los distintos elementos virales necesarios para su formación en 4 plásmidos diferentes: el vector de transferencia del transgen (siRNA-EGFR o la secuencia scramble, siRNA-SCR) y 3 vectores de empaquetamiento (VSV, REV y RRE) que contienen la información para las proteínas de la superficie viral, estructurales y regulatorias. Para producir el virus se co-transfectaron células HEK293T con los vectores empaquetadores y el vector de transferencia con el siRNA-EGFR o siRNA-SCR, mediante el método del fosfato de calcio. Se recolectó el medio (que contiene las partículas virales liberadas por las células) a las 24, 48 y 72 hs post transfección, y se purificó y concentró el virus por ultracentrifugación. Para la determinación del título se transdujeron células HEK293T con diluciones seriadas de la suspensión viral, y se contaron células fluoresncentes, dado que el vector de transferencia posee el gen que codifica para la proteína fluorescente roja. El título final se estimó en 1x108 TU/ml.Para probar in vitro la capacidad silenciadora del siRNA, se co-transfectaron células HEK293T con un plásmido que codifica para el EGFR de rata acoplado a la proteína fluorescente verde (GFP) y con el vector de transferencia que expresa el siRNA-SCR o el siRNA-EGFR. A igual cantidad de células rojas (es decir que incorporaron el vector codificante del siRNA), las placas con siRNA-SCR tuvieron más células verdes (expresan EGFR-GFP) que aquellas con siRNA-EGFR, donde el silenciamiento del receptor disminuyó la expresión de GFP. Seguidamente, y con la idea de probar la efectividad del siRNA in vivo inyectamos el lentivirus en el miocardio de ratas Wistar de cuatro meses de edad (cinco animales con siRNA-EGFR y cuatro con siRNA-SCR). Para la inyección, sepracticó toracotomía entre el 4to y 5to espacio intercostal, bajo anestesia general para exponer el corazón. Se inyectó un volumen de 200 μl en dos sitios de la pared antero-lateral del ventrículo izquierdo con jeringa de insulina y aguja de 30G (ver esquema de la Figura 1B). Los animales fueron sacrificados un mes después de ser inyectados y se comprobó por western blot (WB) en homogenatos de ventrículo izquierdo una reducción significativa del EGFR en aquellos que habían recibido siRNA-EGFR [48±15 vs. 100±6% (siRNA-SCR), P
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