SILENCIAMIENTO DEL INTERCAMBIADOR SODIO/HIDRÓGENO (NHE-1) MIOCARDICO POR INYECCION INTRAPARIETAL

NÉSTOR G. PÉREZ; ARIEL A. DIEZ; HORACIO E. CINGOLANI; PATRICIO E. MORGAN

Buenos Aires

Congreso; XVII Congreso Argentino de Hipertensión Arterial; 2010

Sociedad Argentina de Hipertensión Arterial

El NHE1 es la principal isoforma de NHE en el corazón. Patologías cardíacas como el daño por isquemia/reperfusión, hipertrofia e insuficiencia cardiaca han sido asociadas con la hiperactividad del NHE1. La tecnología del RNA de interferencia permite específicamente reducir la expresión de una proteína, por lo que se diseño siRNA (small intereference RNA) de 19 pb específco para el NHE1. El siRNA fue producido in vitro por hibridización de cadenas complementarias de RNA sintetizadas con la T7 RNA polimerasa. Como control se genero una molécula de siRNA con la misma secuencia desorganizada de manera aleatoria (siRNASCR). La efectividad del siRNA se estudio en células HEK293 que fueron co-transfectadas con una cantidad constante de NHE1 cDNA (1.6 mg) y siRNANHE1. Cantidades crecientes de siRNANHE1 (mg): 0, 1, 4, 10, 40,  inhibieron de manera creciente la expresión de NHE1 con respecto al siRNASCR. Para las dosis antes mencionadas la reducción fue de 100; 56.6 ± 3.5; 41.6 ± 6.8; 17.15 ± 0.2; 8.72 ±7.4; 78.06 ± 3.1 (n=3 cada uno, ANOVA One-way p<0.05) respectivamente. Posteriormente se silenció el NHE1 en corazón de ratón. Bajo anestesia, se inyecto siRNA (20 mg)  cerca del apex en la pared antero-lateral del ventrículo izquierdo. Los ratones fueron sacrificados luego de 48/72 hs de la intervención quirúrgica, se les extrajo el corazón y se midió la expresión proteica en inmunoblots. La expresión del NHE1 en lisado de ventrículos mostró que el siRNANHE1 reduce la expresión a 37.16 ± 5 % (n=5) comparado con los ratones inyectados con siRNAscramble 97.7 ± 13.2 % (n=4; t-test p<0.05). Debido a  la magnitud de la reducción se estudio la expresión del NHE1 en cuatro partes del corazón: Apex, parte media, base y ventrículo derecho. La expresión del NHE1 (como NHE1/GAPDH) mostró una reducción a lo largo de todo el corazón Apex 0.126 ± 0.033, n=3; Medio 0.225 ± 0.079, n=3; Base 0.343 ± 0.098 n=3; Ventrículo derecho 0.793± 0.767; siRNASCR 1.520 ± 0.1700, n=3 (ANOVA one way, P<0.05). Posteriormente se estudió la actividad del NHE1 luego de una carga ácida aguda Se usaron músculos papilares aisalados de VI de ratones inyectados con siRNA NHE1 (n=3) o controles (n=6). Los experimentos se hicieron en un medio libre de bicarbonato (buffer HEPES) para garantizar que la recuperación del pHi fuera debida solo al NHE1. Los papilares con siRNA tuvieron un pHi basal menor (7.02±0.01 vs.  7.21±0.03, P<0.05) y se acidificaron más, luego del pulso de amonio (6.43±0.03 vs 6.60±0.01, P<0.05). Consistentemente, la presencia de siRNA minimizó la recuperación pHi luego de la acidosis (dpHi/dt máximo: 0.132±0.013 vs. 0.021±0.01 unidades de pH/min, P<0.05). Concluimos que la inoculación de RNA de interferencia en un solo lugar en el miocardio es suficiente para reducir la expresión del NHE1 en todo el ventrículo izquierdo. Destacamos la capacidad del siRNA de difundirse desde el sitio de inyección, posiblemente a través del sincitio miocárdico. Por ultimo, corroboramos las dos conclusiones anteriores por la reducción de de la actividad funcional del NHE1 en el músculo papilar.