Dicistroviridae: modificación de la técnica de purificación viral

MARTI GA; METZ GE; SUSEVICH ML; ECHEVERRÍA MG

Buenos Aires

Jornada; XXXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2016

Sociedad Argentina de Virología

La familia Dicistroviridae está compuesta por tres géneros y casi una veintena de especies, la mayoría de ellas de importancia sanitaria o agrícola. Son virus ARN de 30nm de diámetro y simetría icosaédrica. Triatoma virus (TrV), es el único virus entomopatógeno que se encuentra en triatominos. Replica en células del epitelio intestinal, provocando una alta tasa de mortalidad y retraso en el desarrollo de la muda del insecto. TrV se ha postulado para ser utilizado como agente de control biológico para vectores de la Enfermedad de Chagas. Hasta el momento, los protocolos de purificación utilizados se han basado en la utilización de insectos enteros, de su contenido abdominal, sus intestinos o bien en papeles con heces secas de triatominos infectados. Estas técnicas empleadas son prolongadas y no siempre con buena eficiencia.El objetivo del presente estudio es modificar la metodología utilizada hasta el momento, a fin de optimizar la técnica de purificación viral para esta familia viral. Las partículas virales fueron purificadas a partir de materia fecal de 1, 5 y 10 insectos obtenida por compresión abdominal de una colonia experimental infectada con TrV de Triatoma infestans (aprox. 0,0035gr; 0,0101gr; 0,0235gr respectivamente). Cada una de las muestras fue homogeneizada con 150 µl de tampón fosfato, agitada durante 30 seg y centrifugada durante 10 min a 15000 rpm. Este procedimiento se efectuó dos veces más. Por último se realizó una ultracentrifugación durante 3 hs a 22000 rpm a 4°C en rotor SW65, se tomaron alícuotas y se corroboró la presencia de las partículas virales en un gel de poliacrilamida (12,5%). Se cuantificaron las proteínas con el método de Bradford obteniéndose una concentración de aproximadamente 5, 20 y 30 ug/ml respectivamente y se almacenaron las muestras a -20ºC.La duración total de la técnica aquí presentada es de 7:30hs y al comparar el tiempo empleado con otras técnicas de purificación viral, la metodología evidencia una disminución del 30% en el tiempo. La rapidez de nuestra metodología con materia fecal fresca permitiría que las partículas virales sigan activas y que no se sacrifiquen los insectos de la colonia. Además partir de materias fecales o botones permite disminuir la contaminación al realizar el clarificado ya que los contenidos intestinales y el macerado de insectos contiene grasas y restos cuticulares que dificultan el proceso. Todo esto hace que este método posea una mayor eficiencia que la metodología utilizada anteriormente, evidenciando la alta carga viral que posee el intestino de la vinchuca.Cada vez son más los registros en el mundo de estos virus que afectan insectos de importancia medico/sanitaria y agrícola/económica, y son varios los autores que los proponen como controladores biológicos. El desarrollo de metodologías diagnósticas rápidas, fiables y no costosas para detectar infección de TrV podría ser una ventaja útil en futuros estudios para otros Dicistrovirus. Este procedimiento para la purificación de TrV es ventajoso porque evita sacrificar la población de insectos, única fuente hasta el momento de producción de partículas virales, y directamente a partir de una mínima cantidad de materia fecal que no requiere un especial almacenamiento.